牛美麗 賀滉 黨選民 詹園鳳

摘 要 以西瓜葉片為材料，通過正交試驗對影響西瓜OCT酶提取的緩沖液pH值、料液比、提取時間3個因素進行研究，優(yōu)化提取條件。結(jié)果表明，西瓜鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶粗提的最佳條件為緩沖液pH8.5、料液比1 ∶ 5、提取時間4 h。酶學特性的結(jié)果表明：該酶的最適溫度為30 ℃，最適pH為8.0，最適條件下鳥氨酸和氨甲酰磷酸的Km值分別為8.34、3.73 mmol/L，Vmax分別為0.22、0.32 μmol/（mL·min）。金屬離子Ca2+、Mg2+和Mn2+對該酶活力有激活作用，而Fe3+和Cu2+對該酶活力起抑制作用。西瓜OCT酶提取條件的優(yōu)化提高了該酶粗提的效果，為進一步純化該酶奠定基礎(chǔ)；對該酶特性的研究有利于對西瓜瓜氨酸合成代謝及抗逆調(diào)控作用機理的研究。

關(guān)鍵詞 西瓜；鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶；條件優(yōu)化；正交試驗；酶學特性

中圖分類號 Q946 文獻標識碼 A

Optimization on the Extraction Conditions and Properties of

Ornithine Carbamoyltransferase from Watermelon

NIU Meili1， HE Huang2 *， DANG Xuanmin2 *， ZHAN Yuanfeng2

1 College of Agriculture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract Taking the watermelon leaves as the test materials， the pH of the extraction buffer solution， solid-liquid ratio， and extraction time were selected for orthogonal experiment to optimize the extraction process. The optimum conditions for the extraction of ornithine carbamoyltransferase from watermelon were pH8.5， solid-liquid ratio 1 ∶ 5， extraction time 4 h. Enzymatic characterization demonstrated that its optimum temperature and pH was 30 ℃ and 8.0， the Km for ornithine and carbamoyl phosphate value was 8.34 and 3.73 mmol/L， Vmax was 0.22 and 0.32 μmol/（mL·min）， respectively. Metal ions Ca2+， Mg2+ and Mn2+ promoted the enzyme activity， whereas Fe3+ and Cu2+ could inhibit its activity. The optimization on the extraction conditions of crude enzyme of watermelon OCT greatly improved the effect of the crude extraction， and laid the foundation for further purification of the enzyme. The features of the enzyme would be good for the study of watermelon citrulline synthetic metabolism and mechanism of resilience regulation.

Key words Watermelon； Ornithinecarbamoyltransferase； Optimization； Orthogonal experiment； Protease activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.018

西瓜作為備受廣大消費者青睞的水果之一，含有大量葡萄糖、蘋果酸、果糖、氨基酸、番茄素及豐富的維生素C等物質(zhì)，是一種純凈、安全、富有營養(yǎng)的食品。瓜氨酸是西瓜重要的功能性成分之一，是一種非必需氨基酸，因其由西瓜中首次提取獲得而得名[1]。瓜氨酸不僅能促進血液循環(huán)，保護心血管，還可以作為抗衰老、提高免疫力的保健品和女性護膚品[2-5]。此外，瓜氨酸還是一種有效的羥基自由基清除劑和尿素循環(huán)中間體，在西瓜抗逆如抗旱、耐鹽等代謝調(diào)控中發(fā)揮了非常重要的作用[6-9]。

鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶（OCTase/OCT，EC 2.1.3.3）是瓜氨酸合成代謝中的一個關(guān)鍵酶，它廣泛存在于動植物與微生物中。在植物中，OCT是瓜氨酸合成代謝的一個關(guān)鍵酶，同時也是植物尿素代謝途徑中的第一個酶，通過催化鳥氨酸和氨甲酰磷酸反應合成瓜氨酸和磷酸鹽[10]。OCT在植物中最早是由Kleczkowski等[11]從豌豆苗中提取獲得，純化倍數(shù)約2 000倍，回收率達32%。1977年Glenn等[12]從甘蔗線粒體中提取出了OCT。此后，研究者們先后從葡萄[13]、胡蘿卜[14]、狹刀豆[15]、菜豆[16]等植物中提取得到OCT，并對其特性進行了研究，但是未見對西瓜OCT的研究。本研究通過對西瓜OCT粗提條件的優(yōu)化及酶學特性的研究，旨在為進一步純化及更深入地研究酶的相關(guān)特性奠定基礎(chǔ)，同時也有助于對OCT在瓜氨酸循環(huán)及植物抗逆中的作用機理的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：西瓜品種‘美月，來自于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所。

試劑：Tris-HCl緩沖液，L-鳥氨酸，氨甲酰磷酸鹽（CP），三氯乙酸（TCA），安替比林，硫酸，磷酸，硫酸鐵，二乙酰一肟，乙酸，異丙醇，考馬斯亮藍G250，L-瓜氨酸，鹽酸，氫氧化鈉，硫酸鎂，氯化錳，硫酸銅，氯化鈣。

儀器：PHSJ--4A型實驗室pH計（上海），Z326K高速冷凍型離心機（德國），BLH-420電熱恒溫三用水箱（上海），Ultropec-2100pro紫外分光光度計（美國）。

1.2 方法

1.2.1 OCT酶的粗提取 稱取新鮮西瓜葉片6 g，放入研缽中，加入適量Tris-HCl緩沖液冰浴研磨成勻漿，在4 ℃條件下靜置一段時間，然后于4 ℃，10 000 r/min離心20 min，得到上清液即為酶粗提液。先采用對比試驗對影響OTC酶粗提的緩沖液pH值、料液比以及提取時間進行篩選，pH值分別調(diào)整為7.5、8.0、8.5、9.0，料液比（m/V）分別為1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5、1 ∶ 6，提取時間分別為1、2、3、4 h，然后采用正交試驗確定最佳提取條件。

1.2.2 OCT酶活力的測定 酶活力測定方法參考文獻[17-18]，并加以改進。

測定管：取酶液0.1 mL，加入0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液0.5 mL及10 mmol/L CP 0.2 mL，37 ℃水浴中預熱2 min，再加入10 mmol/L鳥氨酸0.2 mL，混勻后于37 ℃水浴中準確保溫15 min，最后加入10% TCA 1.0 mL終止反應。

對照管：取酶液0.1 mL，加入0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液0.5 mL，10 mmol/L CP 0.2 mL以及10% TCA 1.0 mL，37 ℃水浴中預熱2 min，再加入10 mmol/L鳥氨酸0.2 mL，混勻后于37 ℃水浴中準確保溫15 min。將測定管與對照管分別離心取上清液，再分別加入安替比林-酸溶液1.0 mL、二乙酰一肟-異丙醇0.5 mL，于沸水浴中煮沸15 min后取出，冷卻至室溫后于波長460 nm下測定其光吸收值。

酶活力單位定義為1 mL酶液在37.0 ℃和pH8.5的條件下，1 min催化產(chǎn)生1 μmol瓜氨酸為1個酶活力單位，用U表示。

1.2.3 OCT酶的酶學特性 ①酶促反應的最適溫度：取提取的酶液50 μL，加入pH為8.5的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液250 μL，分別放置于25、30、35、40、45、50 ℃溫度下保溫10 min，測定其酶活力。以酶活力（U）為縱坐標，溫度（℃）為橫坐標作圖。重復3次實驗。

②酶促反應的最適pH：取提取的酶液50 μL，分別加入pH為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液250 μL，根據(jù)①節(jié)的實驗結(jié)果，在最適反應溫度條件下保溫測定其酶活力。以酶活力（U）為縱坐標，pH為橫坐標作圖。重復3次實驗。

③酶促反應的Km與Vmax值的測定：a.以鳥氨酸為底物的酶促反應的Km與Vmax值的測定。取提取的酶液50 μL，加入 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（最適pH）250 μL，分別加入濃度為2、4、6、8、10 mmol/mL的鳥氨酸，根據(jù)①節(jié)的實驗結(jié)果，在最適反應溫度條件下測定其酶活力。以底物鳥氨酸的濃度[S]為橫坐標，鳥氨酸的濃度與反應速率的比值[S]/V為縱坐標作圖，測定Km及Vmax值。重復3次實驗。

b.以CP為底物的酶促反應的Km與Vmax值的測定。取提取的酶液50 μL，加入0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（最適pH）250 μL，分別加入濃度為2、4、6、8、10 mmol/mL的CP，根據(jù)①節(jié)的實驗結(jié)果，在最適反應溫度條件下測定其酶活力。以底物CP的濃度[S]為橫坐標，CP的濃度與反應速率的比值[S]/V為縱坐標作圖，測定Km值及Vmax值。重復3次實驗。

④金屬離子對酶活力的影響：取提取的酶液50 μL與 25 μL（濃度為5 mmol/L）不同的金屬離子Ca2+、Mg2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+混合，再加入0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液（最適pH）稀釋到終體積為0.3 mL，根據(jù)①節(jié)的實驗結(jié)果，在最適反應溫度條件下測定其酶活性。以不加金屬離子的酶液的酶活力為對照定義為100%，分別計算加入不同金屬離子后酶活力與對照酶活力的相對百分比。重復3次實驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007與SAS軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的粗提取

2.1.1 不同緩沖液pH值對OCT酶活力的影響

隨著緩沖液pH值的不斷升高，酶活力呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在pH7.5～8.5的范圍內(nèi)，酶活力先急劇后緩慢的升高，在pH8.5達到最大值，之后開始下降（圖1）。因此選取pH為8.5的Tris-HCl緩沖液比較適宜。

2.1.2 料液比對OCT酶活力的影響 在其他因素都確定的情況下，料液比較低時，溶液較粘稠，影響酶的提取效果；料液比較高時，酶活力會下降。因此通過確定最佳料液比，得到的酶量和酶活力都相對較高[19]。本試驗分別選取料液比為1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5、1 ∶ 6，緩沖液pH為8.5，提取3 h，測定酶活力。試驗結(jié)果表明，隨著料液比的降低，酶活力逐漸升高，料液比為1 ∶ 5時達到最大值，然后酶活力開始下降（圖2）。因此，選取料液比為1 ∶ 5比較適宜。

2.1.3 提取時間對OCT酶活力的影響 從植物組織中提取蛋白酶，提取效果與提取溶劑和提取時間有關(guān)。提取時間過短，酶不能充分溶解到提取溶劑中；時間過長，會降低酶活力[20]。在緩沖液pH為8.5、料液比為1 ∶ 5的條件下，不同提取時間對酶活力影響的測定結(jié)果如圖3。在1～3 h內(nèi)，隨著提取時間的延長，酶活力隨之不斷升高，提取時間超過3 h后，酶活力有所下降。故確定提取時間為3 h。

2.2 正交試驗優(yōu)化酶粗液的提取工藝

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化粗酶液提取的條件，以緩沖液的pH，料液比以及提取時間為試驗因素，設(shè)計3因素3水平的正交試驗（表1），以酶的活力為判斷指標，并利用SAS軟件對正交試驗結(jié)果進行方差分析（表2和表3）。由表2正交試驗的極差分析結(jié)果可知，影響西瓜OCT酶活力的因素順序為A>C>B，即緩沖液pH值對西瓜OCT酶活力的影響最顯著，其次是提取時間，最后是料液比。綜合考慮試驗的提取效果，選擇最優(yōu)水平組合為A2B2C3，即西瓜OCT粗提取的最佳條件：Tris-HCl緩沖液的pH為8.5，料液比1 ∶ 5，提取時間為4 h。這與表3的方差分析結(jié)果相同。

2.3 西瓜OCT酶的酶學特性

2.3.1 酶促反應的最適溫度 酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)，適當?shù)臏囟扔欣诿复俜磻?，溫度過高會導致酶失活。如圖4所示，OCT酶活力的最適溫度為30 ℃，隨著溫度的不斷升高，酶活力先升高后降低，在30 ℃時達到最大值。

2.3.2 酶促反應的最適pH 如圖5所示，OCT酶活力的最適pH為8.0。pH小于8.0時，隨著pH的升高酶活力隨之升高，pH達到8.0時酶活力達到最大值，之后隨著pH的升高酶活力逐漸降低。這與Lee等[20]從狹刀豆中提取的OCT酶在刀豆酸作為底物的情況下的最適pH相同。

2.3.3 酶促反應的Km與Vmax值的測定 以鳥氨酸為底物的酶促反應的Km與Vmax值的測定：由2.3.1與2.3.2的結(jié)果可知，OCT酶活力的最適溫度和最適pH分別為30 ℃和8.0，在最適溫度和最適pH條件下，以鳥氨酸的濃度[S]為橫坐標，鳥氨酸濃度與反應速率的比值[S]/V為縱坐標作圖得到Km與Vmax值。如圖6所示，直線的斜率為1/Vmax，直線與X軸的交點為-Km，即OCT酶的Km=8.34 mmol/L，Vmax=0.22 μmol/（mL·min）。

以CP為底物的酶促反應的Km與Vmax值的測定：在最適溫度和最適pH條件下，以CP的濃度[S]為橫坐標，CP濃度與反應速率的比值[S]/V為縱坐標作圖得到Km與Vmax值。如圖7所示，直線的斜率為1/Vmax，直線與X軸的交點為-Km，即OCT酶的Km=3.73 mmol/L，Vmax=0.32 μmol/（mL·min）。

2.3.4 金屬離子對OCT酶活力的影響 由表4可知，Ca2+、Mg2+和Mn2+對OCT酶均有激活作用，而Fe3+對酶活力有較弱的抑制作用，Cu2+的抑制作用最強為87.31%。

3 討論與結(jié)論

本研究以西瓜OCT酶活力為生物水平指標，采用紫外分光光度法為檢測方法，進行酶活力的測定，分別對影響西瓜OCT酶粗提取效果的緩沖液pH、料液比、以及提取時間3個重要因素進行了單因素研究，并通過正交試驗確定了西瓜OCT酶粗提取的最佳條件為Tris-HCl緩沖液pH8.5、料液比1 ∶ 5、提取時間4 h，在此條件下OCT的平均酶活力為11.20 U，且緩沖液pH對該酶活力的影響最顯著，這與Bellocco等[21]研究結(jié)果類似；但肖麗等[22]發(fā)現(xiàn)影響巴西松子中蛋白酶提取的最顯著影響因素是提取時間，這說明不同蛋白酶提取的影響因素顯著性不同，這可能與不同蛋白酶的性質(zhì)有關(guān)。該酶的最適溫度為30 ℃，最適pH為8.0，在此條件下氨甲酰磷酸和鳥氨酸的Km值分別為3.73、8.34 mmol/L，Vmax分別為0.32、0.22 μmol/（mL·min）。OCT酶與氨甲酰磷酸的親和力大于與鳥氨酸的親和力。Ca2+、Mg2+和Mn2+對OCT酶均有激活作用，且Mg2+和Mn2+的激活作用較強，而Fe3+和Cu2+對OCT酶起抑制作用，Laliberté等[23]研究發(fā)現(xiàn)Fe3+對微藻OCT酶起激活作用，這可能與不同物種本身有關(guān)。本研究對西瓜OCT酶粗提條件的優(yōu)化是酶提取的前期步驟，它為該酶的進一步純化奠定了基礎(chǔ)，通過對西瓜OCT酶特性的初步了解，將有助于進一步研究OCT酶在西瓜瓜氨酸合成代謝和尿素循環(huán)中所起到的作用，也為西瓜抗逆代謝調(diào)控研究打下基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] Guo S G， Zhang J G， Sun H H， et al. The draft genome of watermelon（Citrullus lanatus）and resequencing of 20 diverse accessions[J]. Nature Genetics， 2013， 45（1）： 51-58.

[2] Lagerwerf F M， Wever R M F， Van Rijn H J M， et al. Assessment of nitric oxide production by measurement of[15N] citrulline enrichment in human plasma using high performance liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Analytical Biochemistry， 1998， 257（1）： 45-52.

[3] Wiesinger H. Arginine metabolism and the synthesis of nitric oxide in the nervous system[J]. Progress in Neurobiology， 2001， 64（4）： 365-391.

[4] 萬學閃， 劉文革， 閻志紅， 等.無籽西瓜果實不同部位維生素C和番茄紅素含量測定[J]. 中國瓜菜， 2009， 22（3）： 4-9.

[5] 程志強， 劉文革， 鄧 云， 等. 西瓜果實中L-瓜氨酸的提取與測定[J]. 果樹學報， 2010， 27（4）： 650-654.

[6] Akashi K， Miyake C， Yokota A. Citrulline， a novel compatible solute in drought-tolerant wild watermelon leaves， is an efficient hydroxyl radical scavenger[J]. FEBS Letters， 2001， 508（3）： 438-442.

[7] Yokota A， Kawasaki S， Iwano M， et al. Citrulline and DRIP-1 protein（ArgE homologue）in drought tolerance of wild watermelon[J]. Annals of Botany， 2002， 89（7）： 825-832.

[8] Akashi K， Yoshimura K， Nanasato Y， et al. Wild plant resources for studying molecular mechanisms of drought/strong light stress tolerance[J]. Plant Biotechnology， 2008， 25（3）： 257-263.

[9] Dasgan H Y， Kusvuran S， Abak K， et al. The relationship between citrulline accumulation and salt tolerance during the vegetative growth of melon（Cucumis melo L.）[J]. Plant Soil and Environment， 2009， 55（2）： 51-57.

[10] Thompson J F. Arginine synthesis， proline synthesis， and related processes. In： Miflin B J.The Biochemistry of plants.Vol5[M]. New York： Academic Press， 1980： 375-402.

[11] Kleczkowski K， Cohen P P. Purification of ornithine transcarbamylase from pea seedings[J]. Arichives of Biochemistry and Biophysics， 1964， 107（2）： 271-278.

[12] GLenn E， Maretzki A. Properties and Subcellular Distribution of Two Partially Purified Ornithine Transcarbamoylases in Cell Suspensions of Sugarcane[J]. Plant Physiology， 1977， 60（1）： 122-126.

[13] Roubelakis K A， Kliewer W M. Enzymes of krebs-henseleit cycle in Vitis vinifera L.I.Ornithine carbamoyltransferase： isolation and some properties[J]. Plant Physiology， 1978， 62（3）： 337-339.

[14] Baker S R， Yon R J. Characterization of ornithine carbamoyltransferase from cultured carrot cells of low embryogenic potential[J]. Phytochemistry， 1983， 22（10）： 2 171-2 174.

[15] Lee Y， Lee C B， Kim S G， et al. Purification and characterization of ornithine carbamoyltransferase from the chloroplasts of Canavalia lineata leaves[J]. Plant Science， 1997， 12（2）： 217-224.

[16] Lee Y， Jun B O， kim S G， et al. Purification of ornithine carbamoyltransferase from kidney bean（Phaseolus vulgaris L.）leaves and comparison of the properties of the enzyme from canavanine-containing and-deficient plants[J]. Panta， 1998， 205（3）： 375-379.

[17] Slocum R D， Richardson D P. Purification and characterization of ornithine transcarbamylase from pea（Pisum sativum L.）[J]. Plant Physiology， 1991， 96（1）： 262-268.

[18] 施偉紅. 改良二乙酰一肟-安替比林法測定游泳水中尿素[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2008， 18（7）： 1 319-1 320.

[19] 吳憲禹. 蛋白質(zhì)純化實驗方案與應用[M]. 北京： 化學工業(yè)出版社， 2010.

[20] Lee Y， Kwon Y M. Identification of an isoform of ornithine carbamoyltransferase that can effectively utilize canaline as a substrate from the leaves of Canavalia lineata[J]. Plant Science， 2000， 151（2）： 145-151.

[21] Bellocco E， Leuzzi U， De Greqorio A， et al. Partial purification and properties of ornithine carbamoyltransferase from citrus limonum leaves[J]. Biochemistry and Molecular Biology International， 1993， 29（2）： 281-289.

[22] 肖 麗， 應鐵進， 蔡路昀， 等.巴西松子中蛋白酶的分離純化及酶學性質(zhì)[J]. 食品科學， 2013， 34（1）： 239-243.

[23] Laliberté G， Hellebust J A. Partial characterization of ornithine carbamoyltransferase in three microalgae.anabolic role only[J]. Plant Physiology， 1990， 93（1）： 62-66.