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      TLC—HPLC檢測(cè)三黃連合劑的有效成分

      2016-05-30 06:09:12楊劍牛曉藝黃明梁萬(wàn)文胡庭俊
      關(guān)鍵詞:有效成分薄層色譜法高效液相色譜法

      楊劍 牛曉藝 黃明 梁萬(wàn)文 胡庭俊

      摘要:【目的】以薄層色譜法—高效液相色譜法(TLC-HPLC)檢測(cè)三黃連合劑的有效成分,為制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及后期臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)?!痉椒ā坎捎肨LC對(duì)三黃連合劑中的主要組分黃連、黃芩和連翹進(jìn)行定性鑒別,并以HPLC對(duì)其主要有效成分黃芩苷、鹽酸小檗堿和連翹苷進(jìn)行含量測(cè)定?!窘Y(jié)果】三黃連合劑TLC色譜中的圖像斑點(diǎn)清晰,與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照斑點(diǎn)對(duì)齊,顏色一致。HPLC測(cè)定三黃連合劑中黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿分別在75.00~1200.00 μg/mL(r=0.9997)、4.17~66.67 μg/mL(r=0.9998)、9.38~150.00 μg/mL(r=0.9999)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均回收率分別為113.92%、100.18%和100.40%,其含量分別為5.03、0.25和0.27 mg/mL。【結(jié)論】TLC-HPLC可作為三黃連合劑的質(zhì)量控制方法,且操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性良好。

      關(guān)鍵詞: 三黃連合劑;有效成分;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);薄層色譜法(TLC);高效液相色譜法(HPLC)

      中圖分類號(hào): S853.73 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):2095-1191(2016)02-0312-07

      0 引言

      【研究意義】中藥復(fù)方制劑的安全、有效、質(zhì)量可控是其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究與制定的主要目的之一,但中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜,主要成分鑒別與含量測(cè)定是其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵,也可為后期的藥理藥效學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。因此,開(kāi)展中藥復(fù)方制劑主要成分的鑒別與含量測(cè)定,實(shí)現(xiàn)其質(zhì)量可控的目的,對(duì)進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制及安全性和有效性具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái),中藥復(fù)方制劑成分的鑒別、測(cè)定與分析多采用薄層色譜法(Thin layer chromatography,TLC)、高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)等。蒲曉輝等(2007)采用TLC-HPLC分別建立了肝寧顆粒中川芎的鑒別與阿魏酸(FA)含量測(cè)定的方法。隨后,葛建華等(2009)采用HPLC建立了快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定茵陳蒿湯中綠原酸和梔子苷含量的方法;謝薇等(2010)針對(duì)肝康顆粒中黃芪等成分進(jìn)行TLC鑒別,同時(shí)對(duì)大黃素等進(jìn)行HPLC含量測(cè)定;王靜等(2011)同時(shí)對(duì)芪參益氣滴丸中迷迭香酸等5個(gè)丹參活性成分含量進(jìn)行分析,建立了準(zhǔn)確、重復(fù)性好的HPLC和超高效液相色譜法(Ultra performance liquid chromatography,UPLC);劉必旺等(2011)成功建立了HPLC和TLC測(cè)定復(fù)方葛根膠囊中葛根素含量的方法;陳鵬等(2014)分別采用HPLC和TLC對(duì)藏藥十味消食散中桂皮醛、胡椒堿進(jìn)行定性鑒別及含量測(cè)定,成功建立了藏藥十味消食散的質(zhì)量控制方法;Fu等(2015)采用TLC和HPLC分別鑒定了山楂顆粒中大黃酚等3種生物活性物質(zhì);于燕莉等(2015)建立HPLC測(cè)定復(fù)方葛根片中延胡索乙素含量的方法。國(guó)外也有不少學(xué)者對(duì)中藥及其復(fù)方制劑的主要成分進(jìn)行鑒定、檢測(cè)與分析,Gnoatto等(2005)首次采用HPLC-UV對(duì)巴拉圭茶水提物中總皂苷進(jìn)行檢測(cè),并發(fā)現(xiàn)該方法可用于其他中藥三萜式皂苷的檢測(cè);Pandith等(2013)成功采用HPLC對(duì)香澤蘭葉子提取物中的有效活性成分——黃芩素甲基醚進(jìn)行鑒定、測(cè)定及分析?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】三黃連合劑是廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室自主研制的中獸藥復(fù)方制劑,其組成藥物為黃芩、黃連、連翹等,具有抗菌消炎的作用,主要用于羅非魚(yú)鏈球菌病治療,但目前尚無(wú)相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以針對(duì)三黃連合劑建立的TLC定性鑒別方法對(duì)處方中的主要組分(黃連、黃芩和連翹)進(jìn)行定性鑒別,并建立HPLC測(cè)定該復(fù)方中主要有效成分(黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿)的含量,以期為制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及后期臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1. 1 試驗(yàn)材料

      三黃連合劑由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院委托廣西某獸藥公司生產(chǎn)(批號(hào)20130629、20130702和20130705);連翹苷對(duì)照品(批號(hào)110821-201112)、鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)110713-201212)和黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)110715-201117)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。黃連對(duì)照藥材、連翹對(duì)照藥材、黃芩對(duì)照藥材由廣西獸藥監(jiān)察所提供;乙腈(TEDIA)、磷酸(Fisher)為色譜純,其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備:Waters 2695分離單元、Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司),Empower色譜工作站,硅膠H板(100 mm×100 mm,青島海洋化工廠分廠)和硅膠G板(100 mm×100 mm,青島海洋化工廠分廠)。

      1. 2 主要組分的TLC鑒別

      1. 2. 1 供試品溶液制備 分別取3個(gè)批次的三黃連合劑10.0 mL,蒸發(fā)濃縮至1.0 mL,后加入9.0 mL甲醇,通過(guò)無(wú)水中性氧化鋁過(guò)濾除雜后,作供試品溶液備用。

      1. 2. 2 黃芩定性鑒別 取黃芩對(duì)照藥材1.0 g,加醋酸乙酯—甲醇(3∶1)混合溶液30.0 mL,加熱回流30 min,過(guò)濾,濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?.0 mL溶解,上清液即為黃芩對(duì)照藥材溶液。取黃芩苷對(duì)照品0.500 mg,加入甲醇制成0.5 mg/mL的溶液,即為黃芩苷對(duì)照品溶液。然后參照《中國(guó)獸藥典(二部)》中的TLC,分別吸取供試品溶液3.0 μL、黃芩對(duì)照藥材溶液4.0 μL和黃芩苷對(duì)照品溶液4.0 μL,點(diǎn)于同一硅膠H板上,以乙酸乙酯—丁酮—甲酸—水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑展開(kāi),約40 min后取出晾干,噴2%三氯化鐵乙醇顯色。

      1. 2. 3 連翹定性鑒別 取連翹對(duì)照藥材,加石油醚20.0 mL,密塞,超聲處理20 min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?.0 mL溶解,即為連翹對(duì)照藥材溶液。取連翹苷對(duì)照品0.500 mg,加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液,即為連翹苷對(duì)照品溶液。然后參照《中國(guó)獸藥典(二部)》中的TLC,分別吸取供試品溶液3.0 μL、連翹對(duì)照藥材溶液5.0 μL和連翹苷對(duì)照品溶液3.0 μL,點(diǎn)于同一硅膠G板上,以三氯甲烷—甲醇(8∶1)為展開(kāi)劑展開(kāi),約40 min后取出晾干,噴10%硫酸乙醇溶液,于105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

      1. 2. 4 黃連定性鑒別 取黃連對(duì)照藥材,加甲醇25.0 mL,超聲處理30 min,濾過(guò),即為黃連對(duì)照藥材溶液。取黃連小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品0.500 mg,加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液,即為鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。然后參照《中國(guó)獸藥典(二部)》中的TLC,分別吸取供試品溶液2.0 μL、黃連對(duì)照藥材溶液及鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液各3.0 μL,點(diǎn)于同一硅膠H板上,以苯—乙酸乙酯—甲醇—異丙醇—濃氨試劑(6.0∶3.0∶1.5∶1.5∶0.5)為展開(kāi)劑,置于以濃氨試劑預(yù)飽和20 min的展開(kāi)缸內(nèi)展開(kāi),約30 min后取出晾干,置于紫外燈(365 nm)下檢視。

      1. 3 主要有效成分的HPLC測(cè)定

      1. 3. 1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取22.5 mg鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品,適量甲醇溶解并定容至50.0 mL,即為450.0 μg/mL鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密稱取10.0 mg連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品,適量甲醇溶解并定容至50.0 mL,即為200.0 μg/mL連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密稱取36.0 mg黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品,適量甲醇溶解并定容至10.0 mL,即為3.6 mg/mL黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。將以上3種標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液等量混合,即獲得含黃芩苷1.2 mg/mL、連翹苷66.7 μg/mL和鹽酸小檗堿150.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

      1. 3. 2 樣品溶液制備 任取三黃連合劑5.0 mL,甲醇定容至50.0 mL,即制成樣品溶液。按照三黃連合劑的制備方法分別配制缺少黃芩、黃連、連翹的陰性對(duì)照藥品。取陰性對(duì)照藥品5.0 mL,甲醇定容至50.0 mL,即為陰性對(duì)照樣品溶液。

      1. 3. 3 色譜條件 色譜柱:Phenomenex-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);洗脫方式:等度洗脫;流動(dòng)相:0.4%磷酸(A)∶乙腈(B)=75∶25;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):277 nm;柱溫:30 ℃;檢測(cè)時(shí)間:25 min。

      2 結(jié)果與分析

      2. 1 三黃連合劑中3種主要組分的定性鑒別結(jié)果

      2. 1. 1 黃芩定性鑒別結(jié)果 如圖1所示,三黃連合劑供試品TLC色譜中的圖像斑點(diǎn)清晰,供試品斑點(diǎn)與黃芩標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)對(duì)齊,顏色一致,顯示相同的斑點(diǎn)。

      2. 1. 2 連翹定性鑒別結(jié)果 如圖2所示,三黃連合劑供試品TLC色譜中的圖像斑點(diǎn)清晰,供試品斑點(diǎn)與連翹標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)對(duì)齊,顏色一致,顯示相同的斑點(diǎn)。

      2. 1. 3 黃連定性鑒別結(jié)果 如圖3所示,三黃連合劑供試品TLC色譜中的圖像斑點(diǎn)清晰,供試品斑點(diǎn)與黃連標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)對(duì)齊,顏色一致,顯示相同的黃色斑點(diǎn)。

      2. 2 三黃連合劑中黃芩苷、鹽酸小檗堿和連翹苷的含量測(cè)定結(jié)果

      2. 2. 1 線性關(guān)系考察 分別取混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液及不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10.0 μL,按照1.3.3的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定,記錄不同濃度下各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,分別求得黃芩苷、鹽酸小檗堿和連翹苷的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍,結(jié)果如表1所示。

      3 討論

      近年來(lái),在中獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中TLC和HPLC因其快速、開(kāi)放性、靈活性等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用,如對(duì)黃連藥材、飲片及中成藥(康純等,2000)、疏糖瘀膠囊(楊小月和申欣,2007)、黃連供試品溶液(劉占厚等,2012)中的黃連進(jìn)行TLC鑒定,也有對(duì)連翹原料藥進(jìn)行TLC鑒定(張貞麗等,2007;鐘永康,2007)。一些中藥復(fù)方制劑如一清顆粒(陳巧華和林期重,2004)、更年寧心膠囊(周頌東,2009)、止咳化痰丸(孫景等,2014)中黃芩的TLC鑒別也相繼被報(bào)道。同時(shí),有學(xué)者建立了檢測(cè)不同中藥復(fù)方制劑中黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿含量的HPLC測(cè)定方法,其中有單獨(dú)檢測(cè)蒲地藍(lán)消炎片中黃芩苷(邵禮梅等,2012)、清熱化毒丸中黃芩苷(劉匯等,2013)及勝紅清熱片中連翹苷(曾嶸等,2006)、柴連口服液中連翹苷(李銳和陳國(guó)彪,2010);也有同時(shí)測(cè)定安宮牛黃丸中黃芩苷、鹽酸小檗堿和梔子苷(韓鳳梅等,2007),十味龍膽花顆粒中鹽酸小檗堿和龍膽苦苷(徐遠(yuǎn)金等,2007),雙黃消炎片中黃芩苷和鹽酸小檗堿(許國(guó)兵和劉志武,2008),大衛(wèi)顆粒中黃芩苷和連翹苷(姚帥等,2012),二妙丸中鹽酸小檗堿和黃柏堿(張莉和潘超,2011)的研究報(bào)道。上述研究結(jié)果均表明,以TLC和HPLC檢測(cè)中獸藥及其合劑有效成分具有準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好等特點(diǎn),可用于中獸藥質(zhì)量控制。

      三黃連合劑藥味多、成分復(fù)雜,其主要有效成分的紫外吸收差異很明顯,通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描,得知黃芩苷在214.4、277.0和315.1 nm處有最大吸收值,連翹苷在228.5和277.0 nm處有最大吸收值,鹽酸小檗堿在228.5、264.0和346.1 nm處有最大吸收值。由于樣品中連翹苷含量相對(duì)較少,因此在HPLC定量分析時(shí)選取277.0 nm波長(zhǎng)。此外,本研究通過(guò)參考前人(張成志,2008;石瑤等,2009;劉阿靜等,2012)的相關(guān)研究結(jié)果,分別采用乙腈—水、乙腈—磷酸溶液體系等作為流動(dòng)相,以不同體積比進(jìn)樣測(cè)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.4%磷酸(25∶75)作為流動(dòng)相的峰型更優(yōu),分離效果良好(R>1.5%),洗脫時(shí)間最短。

      安全、有效、質(zhì)量可控是對(duì)藥品生產(chǎn)的基本要求,而質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究是藥品質(zhì)量可控的必需過(guò)程。本研究采用TLC-HPLC聯(lián)用的方法對(duì)三黃連合劑進(jìn)行定性定量分析,結(jié)果表明,經(jīng)TLC鑒別獲得的藥材薄層色譜圖斑點(diǎn)清晰,與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)對(duì)齊,顏色一致,說(shuō)明3個(gè)批次三黃連合劑中均含有黃芩、黃連和連翹,即這3味中藥的TLC色譜鑒別可作為制定該中藥合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù);采用HPLC對(duì)三黃連合劑的主要有效成分黃芩苷、鹽酸小檗堿和連翹苷進(jìn)行定量分析,結(jié)果表明該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好,可作為中藥合劑的質(zhì)量控制方法??梢?jiàn),TLC-HPLC可作為對(duì)三黃連合劑鑒別及質(zhì)量控制的檢測(cè)方法。

      4 結(jié)論

      采用建立的TLC-HPLC可對(duì)三黃連合劑的主要組分黃芩、黃連和連翹進(jìn)行定性鑒別及對(duì)黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測(cè)定,能較全面地反映出復(fù)方合劑的質(zhì)量,操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性良好,可作為三黃連合劑的質(zhì)量控制方法。

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      (責(zé)任編輯 蘭宗寶)

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