徐小婷，徐應(yīng)淑，楊　俊

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥劑學(xué)教研室，貴州 遵義　563099)

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技術(shù)與方法

HPLC法測(cè)定復(fù)方石斛顆粒中黃酮類化學(xué)成分的含量

徐小婷，徐應(yīng)淑，楊俊

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥劑學(xué)教研室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 建立高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方石斛顆粒中槲皮素、山奈素和異鼠李素含量的方法。方法 高效液相色譜法測(cè)定黃酮類化學(xué)成分槲皮素、山奈素和異鼠李素含量，色譜柱為Agilent ZORBAX Extend-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水溶液，采用梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果 槲皮素、山奈素和異鼠李素的進(jìn)樣量分別在5～80、5～80、1.875～30 μg/mL，該范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為y=41.592x+34.684(R2=0.999 9)、y=40.24x+36.804(R2=0.999 9)和y=84.668x-44.102(R2=0.999 8)；平均回收率分別為99.69%、100.26%和99.63%，RSD分別為1.59%、1.74%和2.08%(n=6)。結(jié)論 該方法分離良好、精密準(zhǔn)確，可用于復(fù)方石斛顆粒的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]復(fù)方石斛顆粒；槲皮素；山奈素；異鼠李素；HPLC

復(fù)方石斛顆粒是由銀杏葉、山楂和金釵石斛等組成的復(fù)方制劑，研究表明其具有效調(diào)節(jié)大鼠血脂代謝水平，且能提高機(jī)體的抗氧化能力和改善肝組織脂肪變性，有補(bǔ)肝益腎、活血化瘀、化濁降脂的功效，適用于高脂血癥、高粘血癥和脂肪肝等病癥[1]，對(duì)血脂代謝紊亂具有輔助治療作用。由于中藥制劑的藥材來源和提取方式不同等諸多方面的影響，都會(huì)對(duì)其效應(yīng)和產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響[2]，因而為復(fù)方石斛顆粒建立質(zhì)量控制方法及將來的工業(yè)化大生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。已有文獻(xiàn)[3-7]采用高效液相色譜法測(cè)定槲皮素、山奈素和異鼠李素的含量，但從環(huán)境保護(hù)、檢測(cè)效率提高的角度考慮，尚有必要進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件。本文建立了HPLC法檢測(cè)復(fù)方制劑中黃酮類化學(xué)成分槲皮素、山奈素和異鼠李素含量的方法，為復(fù)方石斛顆粒的質(zhì)量控制提供安全、可靠的試驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑Agilent1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；HH-S6型恒溫水浴箱(鄭州長(zhǎng)城科工有限公司)；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；DL-820D型智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。 復(fù)方石斛顆粒(遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院自制，編號(hào)：20150717、20150718、20150719)；槲皮素對(duì)照品(150302，純度：99.73%)、山奈素對(duì)照品(140608，純度：99.24%)、異鼠李素對(duì)照品(141119，純度：98.57%)均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈(色譜純)購(gòu)自美國(guó)TEDIA天地試劑有限公司；水為雙蒸水；其余試劑為分析純。

1.2色譜條件與溶液配制

1.2.1色譜柱Agilent ZORBAX Extend-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為甲醇，B為0.4%磷酸溶液；梯度洗脫，洗脫條件為0～12 min，20%～40% A；12～20 min，40%～43% A；20～27 min，43%～47% A；27～30 min，47%～65% A；流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

1.2.2對(duì)照品溶液配制取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的槲皮素、山奈素和異鼠李素對(duì)照品制成含槲皮素80 μg/mL、山奈素80 μg/mL、異鼠李素30 μg/mL對(duì)照品混合溶液。

1.2.3樣品溶液制備精密稱取復(fù)方顆粒粉末5.0 g，置索氏提取裝置中，加石油醚(60～90 ℃)100 mL加熱回流提取至提取液無色(約3 h)，取出藥渣揮干，置具塞錐形瓶中；向瓶中加入甲醇100 mL，稱重，超聲處理(功率250 W，頻率45 kHz ) 40 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液24 mL，并加25%鹽酸溶液8 mL，稱重，搖勻，置85 ℃水浴中加熱回流90 min，迅速冷卻至室溫，再稱定重量，用溶液(甲醇∶25%鹽酸=3∶1)補(bǔ)足減失的重量，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，作為樣品溶液。

1.2.4空白溶液另取按處方工藝配置的空白輔料適量，按同法配成空白溶液。

2結(jié)果

2.1方法學(xué)考察

2.1.1專屬性考察取空白溶液、對(duì)照品溶液和樣品溶液，按己建立的色譜條件，取10 μL進(jìn)行HPLC分析，分別得色譜圖(見圖1)。槲皮素、山奈素和異鼠李素的保留時(shí)間分別為19.10、26.29和28.51 min。結(jié)果顯示，槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰位置無雜質(zhì)峰出現(xiàn)，輔料不干擾檢測(cè)樣本的測(cè)定，峰型良好。結(jié)果表明，本方法具有較高的專屬性。

A：空白溶液；B:對(duì)照品溶液;C:樣品溶液。1：槲皮素；2：山奈素；3：異鼠李素。圖1　3種溶液的高效液相色譜圖

2.1.2線性關(guān)系考察精密量取槲皮素(80 μg/mL)、山奈素(80 μg /mL)、異鼠李素(30 μg /mL)對(duì)照品混合溶液0.625、1.25、2.5、5.0、7.5 mL分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，進(jìn)樣。按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以各對(duì)照品濃度(x)為橫坐標(biāo)坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，得到槲皮素回歸方程為y=41.592x+34.684，R2=0.999 9；山奈素回歸方程為y=40.24x+36.804，R2=0.999 9；異鼠李素回歸方程為y=84.668x-44.102，R2=0.999 8，分別在5～80、5～80、1.875～30 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3精密度試驗(yàn)精密量取“1.2.2”項(xiàng)下槲皮素(40 μg /mL)、山奈素(40 μg /mL)、異鼠李素(15 μg /mL)的混合溶液10 μL，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。測(cè)得槲皮素、山奈素和異鼠李素峰面積的RSD分別為0.41%、0.62%、0.45%，表明該儀器精密度較好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品溶液分別在配制0、2、4、6、12、24 h時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積，測(cè)得槲皮素、山奈素和異鼠李素峰面積的RSD分別為0.41%、0.62%、0.45%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)(編號(hào)：20150717)樣品，平行測(cè)定6份。測(cè)得槲皮素、山奈素和異鼠李素的峰面積RSD分別為1.82%、2.39%、2.97%(n=6)，表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.1.6回收率試驗(yàn)精密稱取已測(cè)知含量的樣品6份，每份約2.5 g，分別精密加入一定量的槲皮素、山奈素、異鼠李素對(duì)照品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算得加樣回收率及其RSD值(見表1)。

表1復(fù)方石斛顆粒加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

待測(cè)成分稱樣量(g)樣品含量(mg)加入量(mg)測(cè)得量(mg)加樣回收率(%)平均回收率(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,%)槲皮素2.50071.04161.00002.0557101.4199.691.592.50151.04191.00002.017297.532.50091.04171.00002.033399.162.50141.04191.00002.0589101.702.50091.04171.00002.036599.482.50021.04141.00002.030098.86山奈素2.50071.49611.50003.0300102.26100.261.742.50151.49661.50002.957397.382.50091.49631.50003.0200101.582.50141.49661.50002.987099.362.50091.49631.50003.0002100.262.50021.49581.50003.0069100.74異鼠李素2.50070.31240.30000.6131100.2399.632.082.50150.31240.30000.6210102.872.50090.31240.30000.603797.102.50140.31240.30000.606898.132.50090.31240.30000.6147100.772.50020.31240.30000.608498.67

2.2樣品含量測(cè)定取3個(gè)批號(hào)的復(fù)方石斛顆粒，研細(xì)，分別精密稱定5 g，按樣品制備方法制備，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得樣品含量(見表2)。

表2復(fù)方石斛顆粒樣品中槲皮素、山奈素和異鼠李素含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

樣品批號(hào)槲皮素山奈素異鼠李素201507170.43550.59870.1110201507180.44220.60400.1099201507190.43670.59970.1107

3討論

本文在脫脂方法與溶劑的選擇中，參照2015版《中國(guó)藥典》[8]中銀杏葉測(cè)定槲皮素、山奈素和異鼠李素的測(cè)定方法，即索氏提取器回流提取法。此方法雖較張玲等[9]測(cè)定補(bǔ)血草中槲皮素、山奈素和異鼠李素所用超聲法提取所用時(shí)間長(zhǎng)，但超聲提取后的溶劑將直接揮發(fā)掉，造成溶劑的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。但是藥典索氏提取器回流提取法中，采用的三氯甲烷毒性大，故本文選用比三氯甲烷毒性小的石油醚(60～90 ℃)，作為復(fù)方石斛顆粒的脫脂溶劑。

在植物體內(nèi)的黃酮類化合物常與糖結(jié)合成苷類或碳糖基的形式存在，因而為了準(zhǔn)確測(cè)定其苷元的含量，需對(duì)其進(jìn)行水解去糖。參閱文獻(xiàn)酸水解法[10-12]，糖水解的關(guān)鍵因素有溫度、鹽酸含量、水解時(shí)間等。溫度過高將降低黃酮類物質(zhì)的含量，因此我們選取的溫度為85 ℃。對(duì)于鹽酸用量和水解時(shí)間我們進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行比較，選取體積比為5∶1、4∶1、3∶1、2∶1的甲醇∶25%鹽酸進(jìn)行比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相同時(shí)間下當(dāng)甲醇與25%鹽酸體積比為3∶1時(shí)，槲皮素、山奈素和異鼠李素的峰面積和已到達(dá)最大；以水解時(shí)間為30、60、90、120、150 min，甲醇與25%鹽酸體積比為3∶1，測(cè)定各條件下各成分峰面積之和的結(jié)果顯示，在水解時(shí)間90 min時(shí)峰面積之和達(dá)到最大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)峰面積之和反而減少，故水解時(shí)間90 min最為適宜。

本文采用高效液相色譜法建立復(fù)方石斛顆粒中槲皮素、山奈素和異鼠李素的測(cè)定方法，結(jié)果表明該方法安全、可靠、可重復(fù)性強(qiáng)，為復(fù)方石斛顆粒的質(zhì)量控制提供試驗(yàn)依據(jù)。該方法也可為其它中藥復(fù)方制劑中槲皮素、山奈素和異鼠李素的檢測(cè)提供參考。

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[收稿2016-01-13;修回2016-03-15]

(編輯：王福軍)

Simultaneous determination of the flavonoids in Compound Dendrobium particles by HPLC

XuXiaoting,XuYingshu,YangJun

(Department of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To establish the HPLC method determination of quercetin, kaempferol and isorhamneyin in Compound Dendrobium particles. Methods HPLC method was adopted. The Agilent ZORBAX Extend - C18column (150 mm × 4.6 mm, 5 microns) was used with the mobile phase of methanol-0.4% phosphoric acid solution in the gradient elution at 1.0 ml/min. The detection wavelength was 360 nm. The column temperature was 40 ℃ and the volume was 10 μl. Results There was a between the amount of quercetin and peak area in the range of 5～80 μg/ml, kaempferol in the range of 5～80 μg/ml and isorhamneyin in the range of 1.875～30 μg/ml. The liner regression qequations were y=41.592x+34.684 (R2=0.999 9), y=40.24x+36.804 (R2=0.999 9) and y=84.668x-44.102 (R2=0.999 8), respectively. The average recoveries were 99.69% (RSD=1.59%), 100.26% (RSD=1.74%) and 99.63% (RSD=2.08%) with 6 sample in each group. Conclusion This method is well separated, precise and accurate, and could be used for the quality control of Compound Dendrobium particles.

[Key words]Compound Dendrobium particles; quercetin; kaempferol; isorhamneyin; HPLC

[中圖法分類號(hào)]R284.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1000-2715(2016)02-0200-04

[通信作者]徐應(yīng)淑，女，碩士，教授，研究方向：新藥研究與開發(fā)，E-mail:527822816@qq.com。

[基金項(xiàng)目]貴州省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目(NO：QZYY2012-52)；貴州省赤水市科技局資助項(xiàng)目(NO：赤中藥科合[2013])。