陳發(fā)菊，金　鳳，吳　芹，石京山

(遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

淫羊藿苷對SAMP8小鼠肝臟、腎臟及胸腺的保護(hù)作用

陳發(fā)菊，金鳳，吳芹，石京山

(遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察淫羊藿苷(Icariin，ICA)對快速衰老小鼠(SAMP8)的肝臟、腎臟及胸腺的保護(hù)作用，并探索其可能機(jī)制。方法 隨機(jī)選取SAMR1 小鼠作為對照組，雄性SAMP8小鼠隨機(jī)分為4組(每組12只)，SAMP8模型組及ICA(20、40、80 mg/kg)灌胃給藥組，每天1次，連續(xù)3個(gè)月；SAMP8組和SAMR1組小鼠灌胃等體積的雙蒸水，直至8月齡處死，取肝臟、腎臟及胸腺。β-半乳糖苷酶染色法對肝臟和腎臟進(jìn)行染色；生化法檢測肝臟、腎臟及胸腺勻漿上清液中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性。結(jié)果 與SAMR1組相比，肝臟和腎臟的β-半乳糖苷酶染色發(fā)現(xiàn)SAMP8的藍(lán)色顆粒較多；肝臟、腎臟及胸腺勻漿上清液中，SAMP8的MDA含量增多，而SOD和GSH-Px的活性減弱；與SAMP8組相比，ICA給藥組β-半乳糖苷酶染色藍(lán)色顆粒減少；MDA的含量減少，而SOD和GSH-Px的活性增加。結(jié)論 ICA具有保護(hù)肝臟、腎臟及胸腺的作用，其可能的機(jī)制與體內(nèi)β-半乳糖苷酶、SOD、GSH-Px及脂質(zhì)過氧化物有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]淫羊藿苷；β-半乳糖苷酶；丙二醛；谷胱甘肽過氧化物酶

衰老是自然界不可抗拒的自發(fā)過程，它是復(fù)雜的自然現(xiàn)象，表現(xiàn)為機(jī)構(gòu)和機(jī)能衰退，適應(yīng)性和抵抗力減退?？焖偎ダ闲∈?SAMP8)是一種異常的衰老模型，主要以快速衰老為主要特征，SAMP8小鼠在衰老過程中與老齡化的人類有著相似特征[1]。在衰老過程中，氧化應(yīng)激起著非常重要的作用，氧自由基對神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)突觸傳導(dǎo)等方面均有明顯損傷，因此抗氧化應(yīng)激也是延緩組織器官衰老的重要手段[2]。

淫羊藿(epimedium)是小檗科植物，ICA是主要有效成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，ICA研究范圍主要集中在對骨系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)和延緩衰老、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等方面[3]。我室前期研究表明，ICA能改善Tg2576小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能[4]，ICA對自然衰老大鼠在一定程度上具有抗衰老作用并可以改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[5-6]。ICA可長期使用，安全性高，有望走向人類抗衰老的臨床使用[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察SAMP8在衰老過程中肝臟、腎臟及胸腺中β-半乳糖苷酶、SOD、GSH-Px及脂質(zhì)過氧化物的變化及ICA給藥后對這些酶的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1儀器光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)，電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，酶標(biāo)儀(北京平利洋醫(yī)療設(shè)備有限公司)，恒溫水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2動(dòng)物快速衰老小鼠(SAMP8)及對照小鼠SAMR1由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供。

1.3試劑淫羊藿苷購于南京澤朗醫(yī)藥技術(shù)有限公司，經(jīng)HPLC測定純度≥98%；SOD、MDA及GSH-PX購于南京建成生物工程研究所；冰凍切片組織衰老特異性β-半乳糖苷酶購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

1.4分組及給藥隨機(jī)選取SAMR1 小鼠作為對照組，雄性SAMP8小鼠隨機(jī)分為4組(每組12只)，SAMP8模型組及ICA(20、40、80 mg/kg)灌胃給藥組(分別記為ICA20、ICA40和ICA80)，每天1次，連續(xù)3個(gè)月；SAMP8組和SAMR1組小鼠灌胃等體積的雙蒸水，直至8月齡處死，取肝臟、腎臟及胸腺。

1.5β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)小鼠頸椎脫臼處死，4%多聚甲醛透心灌注并固定24 h，30%蔗糖水進(jìn)行脫水24 h，然后用冰凍切片機(jī)取肝臟和腎臟冰凍切片，厚度5 μm，取20～25張，根據(jù)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶試劑盒進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)。

1.6肝臟、腎臟及胸腺中MDA含量、SOD及GSH-PX活性的測定給藥結(jié)束后，小鼠脫臼處死，取肝臟、腎臟及胸腺組織，準(zhǔn)確稱取肝臟、腎臟及胸腺的組織重量，按照重量(g):體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積生理鹽水，剪碎組織，冰浴制備勻漿，2 500～3 000 rpm/min，離心10 min，取上清液放-80 ℃冰箱備用。

2結(jié)果

2.1ICA對β-半乳糖苷酶的影響在肝臟中，SAMR1與SAMP8相比，SAMR1的陽性顆粒散在分布于細(xì)胞質(zhì)中，而在SAMP8組中陽性顆粒增多(P<0.05)。在腎臟中，SAMR1與SAMP8相比，SAMR1的陽性顆粒呈橢圓形分布于細(xì)胞質(zhì)中，而在SAMP8組中陽性顆粒明顯增多(P<0.05)。ICA(20、40、80 mg/kg)與SAMP8相比，給藥組的陽性顆粒明顯減少(P<0.05，見圖1和圖2)。

A：肝臟β-半乳糖苷酶染色結(jié)果(400×)；B：β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)量化統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果與SAMR1組相比，P<0.05；#:與SAMP8組相比，P<0.05?！　D1　ICA對SAMP8小鼠肝臟的β-半乳糖苷酶的影響

2.2ICA對肝臟、腎臟及胸腺中MDA含量、SOD及GSH-PX活性的影響SAMR1與SAMP8相比，

在肝臟、腎臟和胸腺中MDA的含量明顯增加，SOD及GSH-PX的活性明顯降低(P<0.05)。ICA(20、40、80 mg/kg)給藥組與SAMP8組相比，在肝臟、腎臟及胸腺中MDA的含量明顯降低，SOD及GSH-PX的活性明顯增加(P<0.05，見表1、表2和表3)。

組別MDA含量[nmol/mg(pro)]SOD活性[U/mg(pro)]GSH-Px活性[U/mg(pro)]SAMR163.21±1.48498.2±8.43532±182SAMP875.03±1.56*457.4±7.2*1239±581*ICA2066.15±1.78#496.8±12.4#2916±511#ICA4059.78±0.74#541.2±12.1#3938±116#ICA8046.15±0.71#605.8±4.1#4457±346#

*:與SAMR1組相比，P<0.05；#:與SAMP8組相比，P<0.05。

A：腎臟β-半乳糖苷酶染色結(jié)果(400×)；B：β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)量化統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果與SAMR1組相比，P<0.05；#：與SAMP8組相比，P<0.05。圖2　ICA對SAMP8小鼠腎臟的β-半乳糖苷酶的影響

組別MDA含量[nmol/mg(pro)]SOD活性[U/mg(pro)]GSH-Px活性[U/mg(pro)]SAMR1110.10±2.83506.3±10.61448±137SAMP8155.50±4.20*393.3±4.4*1091±86*ICA2085.30±1.98#392.3±1.11418±184#ICA4084.71±1.94#431.8±11.9#1828±192#ICA8067.73±2.60#481.6±21.5#1890±398#

*:與SAMR1組相比，P<0.05；#:與SAMP8組相比，P<0.05。

組別MDA含量[nmol/mg(pro)]SOD活性[U/mg(pro)]GSH-Px活性[U/mg(pro)]SAMR128.72±1.122073±1464441±356SAMP8539.80±14.20*1149±34* 3651±270*ICA2037.91±6.25#1374±48# 4223±887ICA4032.84±3.43#1906±117#4255±357ICA8020.30±1.61#2565±161#5230±838#

*:與SAMR1組相比，P<0.05；#:與SAMP8組相比，P<0.05。

3討論

本實(shí)驗(yàn)采用SAMP8模型小鼠觀察了我省道地中藥材淫羊藿的主要有效成分之一， ICA對肝臟、腎臟及胸腺防衰老的保護(hù)作用?？焖倮匣Ｐ托∈骃AM，由竹田教授于1968年引進(jìn)日本，根據(jù)老化速度分為正常老化的R品系(Senile-Resistant)和快速老化的P品系(Senile-Prone)[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道SAMP8小鼠在3月齡時(shí)就開始迅速衰老，且與人類衰老有相似的特征，是目前公認(rèn)的比較理想的自然衰老癡呆模型[9-10]。β-半乳糖苷酶染色是β-半乳糖苷酶在酸性條件下穩(wěn)定表達(dá)，催化生成藍(lán)色的沉淀產(chǎn)物，在光學(xué)顯微鏡下觀察到藍(lán)色表達(dá)的組織細(xì)胞，可視為組織細(xì)胞復(fù)制性衰老的分子特征。β-半乳糖苷酶染色法用于鑒定細(xì)胞衰老程度，藍(lán)色顆粒數(shù)的多少反映組織衰老的程度[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ICA減少了肝臟和腎臟的藍(lán)色顆粒數(shù)表達(dá)，提示ICA可能對肝臟和腎臟具有防衰老的保護(hù)作用。

許多臨床研究已經(jīng)報(bào)道了氧化應(yīng)激參與衰老的過程[12]，自由基是脂質(zhì)過氧化，促進(jìn)衰老的重要因子。內(nèi)源性抗氧化物酶SOD和GSH-Px能清除體內(nèi)自由基。MDA是一個(gè)通過自由基誘導(dǎo)的重要脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，被用作氧化應(yīng)激的生物學(xué)標(biāo)記[13]。MDA能導(dǎo)致細(xì)胞膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損，有研究表明在SAMP8小鼠的幼年期脂質(zhì)過氧化物的水平比SAMR1小鼠顯著升高，并認(rèn)為這可能是導(dǎo)致肝臟、腎臟等器官衰老的原因[14-15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在SAMP8小鼠的肝臟、腎臟和胸腺勻漿上清液中，氧化應(yīng)激水平比同月齡的SAMR1小鼠明顯升高，包括MDA含量增加，GSH-Px和SOD的活力下降。ICA給藥后MDA含量減少，GSH-Px和SOD的活性增加，表明ICA具有抗自由基氧化的作用。

綜上所述，ICA對肝臟、腎臟和胸腺具有防衰老的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與提高體內(nèi)抗自由基氧化有關(guān)。

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[收稿2016-01-05;修回2016-03-09]

(編輯：王靜)

Protection of Icariin on liver, kidney and thymus in SAMP8 mice

ChenFaju,JinFeng,WuQin,ShiJingshan

(Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To investigate the protection of Icariin (ICA) on of liver, kidney and thymus in senescence accelerated mouse prone 8 (SAMP8) mice and further explore the possible underlying mechanisms.Methods SAMP8 mice were randomly divided into model group, ICA low-, middle- and high-dose of ICA groups. whereas SAMR1 mice selected as control group. Low-, middle- and high-dose of ICA group were administered with ICA at doses of 20, 40 and 80 mg/kg for consecutive 3 months. Control and model groups were administered with double-distilled water. Then, mice were sacrificed and liver, kidney and thymus were collected. β-galactosidase staining were performed to observe the number of aging cells in the liver and kidney. Moreover, the biochemical method was used to detect the content of malondialdehyde (MDA) and the activities of glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD) in the liver, kidney and thymus homo genates.Results Compared with the control group, the mean number of blue particles and the content of MDA were significantly increased in the liver and kidney and the activities of GSH-Px and SOD were dramaticlly decreased in liver, kidney and thymus homogenates of model group. However, the mean number of blue particles and the content of MDA significantly were decreased, and the activities of GSH-Px and SOD were markedly increased in liver, kidney and thymus homogenates of ICA treatment group.Conclusion ICA could protect liver, kidney and thymus in SAMP8 mice, and the possible mechanisms might be related to the activity of SA-β-gal, SOD, GSH-Px and lipid peroxide.

[Key words]Icariin; β-galactosidase; MDA; GSH-Px

[中圖法分類號(hào)]R964

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1000-2715(2016)02-0150-04

[通信作者]石京山，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理，E-mail:shijs@zmc.edu.cn。

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81160400)。