陳樹杰

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲 056001)

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苦參素對心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應激和細胞凋亡的影響

陳樹杰

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲 056001)

[摘要]目的研究苦參素對心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應激和心肌細胞凋亡的影響。方法將120只雄性SD大鼠隨機分為假手術組，模型組，苦參素低(25 mg/kg)、中(50 mg/kg)、高(100 mg/kg)劑量組和地爾硫卓(1 mg/kg)組；除假手術組外，其余各組大鼠均通過夾閉冠狀動脈30 min后松夾的方法制備心肌缺血再灌注損傷模型；再灌注后各給藥組立即通過腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)7 d，假手術組和模型組給予等體積生理鹽水。末次給藥后，生化分析法測定血清谷草轉氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)水平；通過TTC染色法測定心肌梗死面積，通過蘇木精-尹紅(HE)染色觀察心肌組織病理形態(tài)學改變；測定心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，總抗氧化能力(T-AOC)水平以及丙二醛(MDA)含量；通過原位細胞凋亡檢測(TUNEL)法觀察心肌細胞凋亡狀況并計算凋亡指數(shù)；通過免疫組織化學(IHC)法檢測心肌組織中bcl-2、bax蛋白表達情況并進行半定量分析，計算bcl-2/bax比值。結果苦參素中、高劑量組大鼠血清AST、CPK、LDH水平明顯低于模型組(P均<0.05)，心肌梗死面積明顯小于模型組(P均<0.05)；心肌組織中SOD活性顯著高于模型組(P均<0.05)， MDA含量顯著低于模型組(P均<0.05)，其中苦參素高劑量組GSH-Px活性和T-AOC水平均顯著高于模型組(P均<0.05)。各給藥組大鼠心肌組織病變不同程度改善，其中以苦參素高劑量組效果最為顯著；各給藥組大鼠心肌細胞凋亡狀況明顯好轉，苦參素中、高劑量組凋亡指數(shù)明顯低于模型組(P均<0.05)；苦參素中、高劑量組大鼠心肌組織中bcl-2表達量和bcl-2/bax比值明顯高于模型組(P均<0.05)，bax表達量明顯低于模型組(P均<0.05)。結論苦參素對心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應激損傷和心肌細胞凋亡具有抑制作用；作用機制可能與其能夠改善抗氧化酶活性、促進抑制凋亡蛋白bcl-2表達、抑制促凋亡蛋白bax表達并提高bcl-2/bax比值有關。

[關鍵詞]苦參素；心肌；缺血再灌注；氧化應激；凋亡

苦參素(Oxymatrine，OMT)是從中藥苦參(Sophora flavescens Ait.)中提取的一種喹諾西啶類生物堿，其具有抗炎、抗病毒、抗細胞凋亡、抗肝纖維化等多種生物學活性[1-3]，對腎臟、肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用[4-5]，但其是否對體外心肌細胞缺氧復氧損傷具有保護作用尚不明確。本實驗通過夾閉冠狀動脈30 min后松夾恢復血流再灌注的方法制備心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，研究苦參素對心肌缺血再灌注損傷大鼠的保護作用，并探討其可能的作用機制。

1實驗資料

1.1試驗藥物與試劑苦參素(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號：20141025，純度≥98%)；注射用鹽酸地爾硫卓(天津田邊制藥有限公司，批號：1408026)；紅四氮唑(TTC)(美國Sigma公司)；谷草轉氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TUNEL檢測試劑盒(北京博奧森科技有限公司)；bcl-2、bax免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2實驗動物清潔級雄性SD大鼠，8周齡，體質量220～260 g，購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003，動物合格證號：201411012。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫23～25 ℃，相對濕度60%～70%，光照周期12 h∶12 h。

1.3主要儀器DH-150型動物人工呼吸機(浙江大學醫(yī)學儀器有限公司)；wi93962生物機能實驗系統(tǒng)(北京北瑞達醫(yī)藥科技有限公司)；BS-300全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；UV762型紫外可見分光光度計(上海楚定分析儀器有限公司)；BI-2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)；倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司)；石蠟切片機(德國Leica公司)。

1.4動物分組與模型制作將120只SD大鼠隨機分為假手術組，模型組，苦參素低(25 mg/kg)、中(50 mg/kg)、高(100 mg/kg)劑量組和地爾硫卓(1 mg/kg)組各20只。除假手術組大鼠外，其余各組大鼠均參照徐叔云等[6]報道的實驗方法制備心肌缺血再灌注損傷大鼠模型：腹腔注射烏拉坦實施麻醉，通過肢體二導聯(lián)心電圖監(jiān)測心功能；氣管切開后插管并連接動物呼吸機(參數(shù)設置：頻率60次/min，潮氣量20 mL/kg，呼吸比1.5∶1)，穩(wěn)定10 min后打開胸腔，剪開心包暴露心臟，于左心耳下緣約2 mm處夾閉冠狀動脈，心電圖示ST段抬高或T波高聳表示心肌缺血；30 min后松開動脈夾恢復血流灌注，抬高的ST段降低或高聳的T波得以恢復表示心肌再灌注成功；假手術組行手術通路，除不夾閉冠狀動脈外，其余操作與模型組完全一致。再灌注后，各給藥組立即腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)7 d，假手術組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.5觀察項目

1.5.1血清AST、CPK、LDH水平測定末次給藥后24 h，麻醉后開腹經(jīng)腹主動脈取血，經(jīng)1 500 r/min離心10 min后取血清，按照各試劑盒操作步驟，通過全自動生化分析儀平行測定各種大鼠血清AST、CPK、LDH水平。

1.5.2心肌梗死面積的測定取血完成后，每組隨機取5只開胸取心臟組織，-20 ℃凍存20 min后進行切片處理，然后于37 ℃環(huán)境中通過1%TTC溶液避光孵育15 min后，正常組織呈紅色、梗死區(qū)呈灰白色，然后通過BI-2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)計算心肌組織梗死面積。

1.5.3心肌組織病理形態(tài)觀察每組隨機取5只大鼠，參照1.5.2方法，摘取心臟組織，經(jīng)過4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)和展片處理后，進行常規(guī)HE染色，然后通過倒置光學顯微鏡觀察各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學變化。

1.5.4心肌組織中SOD、GSH-Px活性及T-AOC水平和MDA含量的測定參照1.5.2方法，取每組剩余10只大鼠心臟組織，剪碎、加入適量冷裂解液后進行研磨勻漿，經(jīng)3 000 r/min離心10 min后取上清液，按照各試劑盒要求，通過紫外可見分光光度計平行測定各組大鼠心肌組織中SOD、CAT活性，T-AOC水平和MDA含量。

1.5.5心肌細胞凋亡的觀察及凋亡指數(shù)的計算取1.5.3所制備的心肌組織石蠟切片，按照試劑盒操作步驟行TUNEL染色(細胞核黃褐色為陽性著色)，然后通過光學顯微鏡觀察各組大鼠心肌細胞凋亡狀況，計算心肌細胞凋亡指數(shù)：每張染色切片隨機選取10個視野，分別計數(shù)每個視野中細胞總數(shù)和陽性著色細胞數(shù)，取平均值，凋亡指數(shù)(%)=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.5.6心肌組織中bcl-2、bax蛋白表達的檢測及半定量分析取1.5.3所制備的心肌組織石蠟切片，按照SP試劑盒操作方法步驟，通過免疫組織化學(IHC)方法測定各組大鼠心肌組織中bcl-2、bax蛋白表達量；每張切片隨機選取10個視野，通過BI-2000醫(yī)學圖像分析軟件測定平均光密度(Optical Density，OD)值；根據(jù)OD值計算bcl-2/bax比值。

2結果

2.1各組大鼠血清中AST、CPK、LDH水平比較模型組大鼠血清AST、CPK、LDH水平均明顯高于假手術組(P均<0.05)，苦參素中、高劑量組大鼠血清AST、CPK、LDH水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血清AST、CPK、LDH水平比較

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠心肌組織梗死面積假手術組心肌組織梗死面積為(0.0±0.0)%，模型組為(46.3±5.8)%，苦參素低劑量組為(40.5±6.7)%，苦參素中劑量組為(31.9±5.0)%，苦參素高劑量組為(23.6±4.1)%，地爾硫卓組為(34.2±4.8)%。模型組大鼠心肌組織梗死面積明顯高于假手術組(P<0.05)；苦參素中、高劑量組大鼠心肌組織梗死面積明顯低于模型組(P均<0.05)。

2.3各組大鼠心肌組織結構形態(tài)HE染色發(fā)現(xiàn)，假手術組大鼠心肌纖維平行排列，心肌細胞形態(tài)正常，未見異常；模型組大鼠心肌纖維紊亂、斷裂，間質水腫變性，心肌細胞呈空泡變性、胞質著色不均、胞核固縮等；苦參素低、中、高劑量組大鼠心肌組織病理形態(tài)學變化與模型組比較有不同程度的好轉，其中以苦參素高劑量組改善最為明顯。見圖1～6。

圖1　假手術組心肌組織病理形態(tài)學表現(xiàn)(HE)

2.4各組大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px活性，T-AOC水平和MDA含量比較模型組大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px活性和T-AOC水平均明顯低于假手術組(P均<0.05)，MDA含量明顯高于假手術組(P<0.05)；苦參素中、高劑量組大鼠心肌組織中SOD活性與模型組比較顯著升高且MDA含量顯著降低(P均<0.05)，其中苦參素高劑量組GSH-Px活性和T-AOC水平均顯著高于模型組(P均<0.05)。見表2。

圖2　模型組心肌組織病病理形態(tài)學表現(xiàn)(HE)

圖3　苦參素低劑量組心肌組織病理形態(tài)學表現(xiàn)(HE)

圖4　苦參素中劑量組心肌組織病理形態(tài)學表現(xiàn)(HE)

圖5　苦參素高劑量組心肌組織病理形態(tài)學表現(xiàn)(HE)

圖6　地爾硫卓組心肌組織病理形態(tài)學表現(xiàn)(HE)

組別nSOD/(IU/mg)GSH-Px/(IU/mg)T-AOC/(IU/mg)MDA/(nmol/mg)假手術組1081.5±9.64.7±0.813.4±2.82.1±0.3模型組1049.2±7.0①2.5±0.7①7.6±2.1①3.2±0.4①苦參素低劑量組1056.4±8.12.8±1.28.3±2.62.8±0.7苦參素中劑量組1063.8±10.5②3.0±1.19.0±3.12.5±0.6②苦參素高劑量組1069.6±11.7②3.8±1.4②10.8±3.4②2.3±0.5②地爾硫卓組1061.5±9.8②3.1±1.49.2±3.32.1±0.4②

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.5各組大鼠心肌細胞凋亡及凋亡指數(shù)比較假手術組大鼠心肌細胞僅可見極少量凋亡細胞，而模型組大鼠心肌細胞凋亡數(shù)量明顯增多；與模型組比較，苦參素各劑量組大鼠心肌細胞凋亡數(shù)量呈不同程度減少，其中以苦參素高劑量組最為顯著，見圖7～12。假手術組凋亡指數(shù)為(2.7±1.3)%，模型組凋亡指數(shù)為(59.4±10.6)%，苦參素低劑量組凋亡指數(shù)為(47.5±9.3)%，苦參素中劑量組凋亡指數(shù)為(41.0±7.2)%，苦參素高劑量組凋亡指數(shù)為(28.9±5.6)%，地爾硫卓組凋亡指數(shù)為(42.3±6.8)%。模型組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)明顯高于假手術組(P<0.05)，苦參素中、高劑量組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)明顯低于模型組(P均<0.05)，且苦參素高劑量組明顯低于苦參素低、中劑量組(P均<0.05)。

圖7　假手術組心肌細胞凋亡表現(xiàn)(TUNEL)

圖8　模型組心肌細胞凋亡表現(xiàn)(TUNEL)

2.6各組大鼠心肌組織中bcl-2蛋白表達IHC染色表現(xiàn)模型組大鼠心肌組織中bcl-2蛋白表達與假手術組比較明顯上調；而苦參素中、高劑量組大鼠bcl-2蛋白表達與模型組比較進一步上調，其中以苦參素高劑量組效果最為顯著。見圖13～18。

2.7各組大鼠心肌組織中bax蛋白表達IHC染色表現(xiàn)模型組大鼠心肌組織中bax表達與假手術組比較明顯上調，而苦參素中、高劑量組大鼠bcl-2表達與模型組比較明顯下調，其中以苦參素高劑量組效果最為顯著。見圖19～24。

圖9　苦參素低劑量組心肌細胞凋亡表現(xiàn)(TUNEL)

圖10　苦參素中劑量組心肌細胞凋亡表現(xiàn)(TUNEL)

圖11　苦參素高劑量組心肌細胞凋亡表現(xiàn)(TUNEL)

圖12　地爾硫卓組心肌細胞凋亡表現(xiàn)(TUNEL)

圖13　假手術組心肌組織bcl-2蛋白表達IHC染色表現(xiàn)

圖14　模型組心肌組織bcl-2蛋白表達IHC染色表現(xiàn)

圖16　苦參素中劑量組心肌組織bcl-2蛋白表達IHC染色表現(xiàn)

圖17　苦參素高劑量組心肌組織bcl-2蛋白表達IHC染色表現(xiàn)

圖18　地爾硫卓組心肌組織bcl-2蛋白表達IHC染色表現(xiàn)

圖19　假手術組心肌組織bax蛋白表達IHC染色表現(xiàn)

圖20　模型組心肌組織bax蛋白表達IHC染色表現(xiàn)

圖21　苦參素低劑量組心肌組織bax蛋白表達IHC染色表現(xiàn)

2.8各組大鼠心肌組織中bcl-2、bax蛋白表達OD值及bcl-2/bax比值比較模型組大鼠心肌組織中bcl-2、bax蛋白表達OD值均明顯高于假手術組(P均<0.05)，bcl-2/bax比值明顯低于假手術組(P均<0.05)；苦參素中、高劑量組大鼠心肌組織中bcl-2 蛋白表達OD值和bcl-2/bax比值均明顯高于模型組(P均<0.05)，bax蛋白表達OD值均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表3。

圖22　苦參素中劑量組心肌組織bax蛋白表達IHC染色表現(xiàn)

圖23　苦參素高劑量組心肌組織bax蛋白表達IHC染色表現(xiàn)

圖24　地爾硫卓組心肌組織bax蛋白表達IHC染色表現(xiàn)

3討論

冠心病及其所引發(fā)的急性心肌梗死是臨床常見的心血管疾病，目前臨床上主要采取溶栓、介入手術等冠狀動脈再通術及時恢復血流供應，明顯降低了心肌梗死患者的病死率，但“再灌注損傷”的存在嚴重影響著該類患者的預后。近年來，隨著病理生理學研究的深入，發(fā)現(xiàn)再灌注后出現(xiàn)的氧化應激損傷以及繼發(fā)的細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)[7-8]，這也為今后研發(fā)抗心肌缺血再灌注損傷的新型藥物提供了方向。

表3　各組大鼠心肌組織中bcl-2、bax蛋白表達OD值及bcl-2/bax比值比較

注：①與假手術組比較,P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

血清中心肌酶(AST、CPK、LDH)含量是臨床上診斷心肌細胞損傷的常用指標。生理狀態(tài)下，血清中心肌酶含量都非常低；當心肌細胞膜受氧自由基攻擊受損后，AST、CPK、LDH將迅速釋放入血而導致三者含量陡然增高，所以它們在血清中的水平能夠敏感地反映心肌細胞受損程度[9-10]。SOD被稱為體內防御氧自由基損傷的第一道屏障，它能夠提供氫原子配體而催化還原氧自由基生成過氧化氫[10]，并且在GSH-Px的催化作用下能夠進一步被還原生成對人體無害的水和氧[11]；心肌組織中T-AOC水平能夠反映心肌抵抗氧自由基損傷能力，脂質過氧化終產(chǎn)物MDA含量能夠間接反映心肌細胞氧化應激損傷程度。

細胞凋亡是多種基因參與的主動性細胞死亡過程，存在著非常復雜的調控機制；其中bcl-2為凋亡抑制基因，bax為促凋亡基因，它們均屬于bcl-2基因家族，二者間相互作用、共同調控細胞凋亡[12]；進一步研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡不僅與bcl-2和bax的表達密切相關，更依賴于bcl-2/bax比值[13]。

苦參素是一種具有多種藥理學作用的喹諾西啶類生物堿，本實驗發(fā)現(xiàn)，苦參素能夠顯著降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織梗死面積，改善心肌組織病變，降低血清中心肌酶(AST、CPK、LDH)含量，提高SOD、GSH-Px活性及T-AOC水平，降低MDA含量；抑制心肌細胞凋亡，提高抑凋亡蛋白bcl-2表達，降低促凋亡蛋白bax表達，提高bcl-2/bax比值。提示苦參素對心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應激和細胞凋亡具有抑制作用；其作用機制與苦參素能夠有效增強抗氧化酶活性，調節(jié)凋亡相關蛋白表達有關。

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Effects of oxymatrine on oxidative stress and apoptosis in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury

CHEN Shujie

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of oxymatrine(OMT) on oxidative stress and myocardial apoptosis in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury. Methods 120 rats were randomly divided into six groups: sham operation group, model control group, OMT(25, 50, 100 mg/kg) treated groups and diltiazem (1 mg/kg) treated group (positive control group); except the rats in sham operation group, the rat models were made by clamping the artery for 30 min, and the drugs were given after reperfusion immediately, once a day for 7 days. Seven days later, the areas of myocardial infarction were analyzed by TTC staining, the histopathological changes was observed by HE staining; the content of AST, CPK, LDH in serum were determined; the activity of SOD, GSH-Px, T-AOC and the content of MDA in myocardial tissue were determined. The apoptosis of cardiomyocytes was observed by TUNEL and the apoptosis index was calculated; the expression of bcl-2, bax were detected by IHC and were Semi-quantitative analyzed, and the ratio of bcl-2/bax was calculated. Results Compared with the model control group, the areas of myocardial infarction of OMT 50, 100 mg/kg treated groups were significantly decreased(P all<0.05); the histopathological changes were significantly improved, especially in the OMT 100 mg/kg treated group; the content of AST, CPK, LDH in serum of OMT 50, 100 mg/kg treated groups were significantly decreased(P all<0.05); the activity of SOD in myocardial tissue was significantly increased and the content of MDA significantly was decreased (P all<0.05), the activity of GSH-Px and the level of T-AOC in OMT 100 mg/kg treated group were significantly increased(P<0.05). The cardiomyocytes apoptosis of OMT treated groups were significantly improved, and the apoptosis index of OMT 50, 100 mg/kg treated groups were significantly decreased(P all<0.05); the expression of bcl-2 was significantly up-regulated, the expression of bax was significantly down-regulated, and the ratio of bcl-2/bax in OMT 50, 100 mg/kg treated groups were significantly increased(P all<0.05). Conclusion OMT had inhibition effects on oxidative stress and myocardial apoptosis in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury, which perhaps related to its effects of enhancing the activity of antioxidant enzymes, up-regulating the expression of bcl-2 and down-regulating the expression of bax, enhancing the ratio of bcl-2/bax.

Key words:oxymatrine; myocardial ischemia-reperfusion; oxidative stress; apoptosis

[收稿日期]2015-06-12

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)05-0476-07

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.05.007

[作者簡介]陳樹杰，男，碩士，副主任醫(yī)師，從事心臟疾病研究工作。