張濤，夏虹，尹慶水，李梅，張余，楊小明，藍(lán)國(guó)波

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鈣磷涂層鎂合金CaP-AZ31B對(duì)小鼠前成骨細(xì)胞生物學(xué)性能的影響

張濤，夏虹，尹慶水，李梅，張余，楊小明，藍(lán)國(guó)波

【摘要】目的研究鈣磷涂層鎂合金CaP-AZ31B對(duì)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1生物學(xué)性能的影響。方法實(shí)驗(yàn)分為鎂合金（AZ31B）組、鈦合金組和CaP-AZ31B組，觀察MC3T3-E1細(xì)胞在3組材料表面2、6、24 h的細(xì)胞黏附率；倒置顯微鏡觀察MC3T3-E1細(xì)胞與3組材料浸提液共培養(yǎng)1、3、5、7 d的細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)采用CCK法和BCA法檢測(cè)其細(xì)胞增殖活力和細(xì)胞內(nèi)總蛋白。結(jié)果隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，3組材料的細(xì)胞黏附率、細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞內(nèi)總蛋白量均顯著增加（P＜0.05）。其中CaP-AZ31B組2、6、24 h細(xì)胞黏附率＞鈦合金組＞AZ31B組（P＜0.05）；MC3T3-E1細(xì)胞在3組材料浸提液中貼壁均良好，大多呈長(zhǎng)梭形；CaP-AZ31B組各時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞增殖活力均優(yōu)于AZ31B組（P＜0.05）；細(xì)胞內(nèi)總蛋白量比較，CaP-AZ31B組＞鈦合金組＞AZ31B組（P＜0.05）。結(jié)論與鎂合金、鈦合金相比，鈣磷涂層鎂合金材料可明顯增強(qiáng)小鼠成骨細(xì)胞的黏附能力和增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)總蛋白的表達(dá)，具有良好的生物相容性。

【關(guān)鍵詞】鎂；合金；磷酸鈣類；涂層；生物相容性材料；小鼠；成骨細(xì)胞；細(xì)胞，培養(yǎng)的；黏附；增殖

作者單位：510010廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院骨科醫(yī)院全軍創(chuàng)傷骨科研究所全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張濤，夏虹，尹慶水，李梅，張余，楊小明，藍(lán)國(guó)波）；510010廣州華博生物制藥研究所（張濤）

鈦合金是目前骨科常用的植入材料，但難以在人體內(nèi)降解，需行二次內(nèi)固定取出術(shù)，不但增加患者的痛苦，而且加重其經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?？山到怄V合金能夠彌補(bǔ)鈦合金材料的上述缺陷，但降解速度較快，難以滿足臨床需要。運(yùn)用表面改性技術(shù)對(duì)鎂合金進(jìn)行鈣磷涂層可有效延緩鎂合金的降解速度，但目前尚不明確鈣磷涂層鎂合金對(duì)成骨細(xì)胞黏附、增殖等生物學(xué)性能的影響。本研究通過(guò)觀察小鼠前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1細(xì)胞）在鈣磷涂層鎂合金表面的黏附性能，以及該合金浸提液對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞內(nèi)總蛋白量的影響，旨在進(jìn)一步了解其生物相容性。

1　材料與方法

1.1主要儀器、材料和試劑

24孔、96孔培養(yǎng)板（Corning公司，美國(guó)）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；TY-80s搖床（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）。

鎂鋁合金（AZ31B）圓盤、鈣磷涂層鎂鋁合金（CaP-AZ31B）圓盤、鈦合金圓盤由中國(guó)科學(xué)院金屬所提供，直徑10 mm、厚3 mm。

α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液、優(yōu)等胎牛血清、胰蛋白酶（Hyclone公司，美國(guó)）；CCK-8試劑盒（同仁化學(xué)研究所，日本）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma-A ldrich公司，美國(guó)）；BCA蛋白試劑盒（Pierce公司，美國(guó)）；Triton-X100（Sigma-Aldrich公司，美國(guó)）。

1.2浸提液制備

按材料表面積/浸提介質(zhì)為2.5 cm2/m L的比例［1］，分別向裝有CaP-AZ31B、AZ31B和鈦合金材料的容器中加入含10%胎牛血清的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別制備出CaP-AZ31B、AZ31B和鈦合金浸提液，4℃冷藏備用，24 h內(nèi)使用。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組

采用小鼠MC3T3-E1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供。加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3 d換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)分為CaP-AZ31B組、AZ31B組和鈦合金組。

1.4早期細(xì)胞黏附率測(cè)定

將CaP-AZ31B、AZ31B和鈦合金試件分別置于3個(gè)24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每種試件18個(gè)。將MC3T3-E1細(xì)胞以1×105/孔分別接種于上述培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2、6、24 h，每時(shí)相點(diǎn)取出1個(gè)培養(yǎng)板，每組取出6個(gè)試件。PBS漂洗3次，吸凈液體，0.25%胰蛋白酶1.0 mL消化1 min，用1.0 mL含血清培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，吹打制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，重復(fù)6次，取平均值，計(jì)算細(xì)胞黏附率。細(xì)胞黏附率=已貼壁細(xì)胞數(shù)/植入細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5細(xì)胞形態(tài)、增殖活力及總蛋白測(cè)定

將1×104/mL細(xì)胞懸液接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后更換為3種條件浸提液，2 d換液1次，分別培養(yǎng)1、3、5、7 d。

1.5.1細(xì)胞形態(tài)觀察使用倒置相差顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.5.2細(xì)胞增殖活力測(cè)定棄浸提液，PBS清洗后加入CCK-8試劑20 μL后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm處光密度（optical density，OD）值。

1.5.3細(xì)胞內(nèi)總蛋白量測(cè)定PBS沖洗3遍，加入0.2%Triton-X100 200 μL裂解細(xì)胞，4℃冰箱過(guò)夜，分別吸取25 μL各組裂解液加入新的96孔板中，然后加入200 μL BCA蛋白試劑盒顯色劑，振動(dòng)30 s。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃下孵育30 min，取出培養(yǎng)板，冷卻至室溫，酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm處OD值。根據(jù)蛋白濃度與OD值之間的函數(shù)關(guān)系計(jì)算各種樣品的吸附蛋白量，每組重復(fù)6次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，多組比較采用多因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1早期細(xì)胞黏附率

如表1所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，3組材料細(xì)胞黏附率均顯著增加，不同時(shí)相點(diǎn)之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CaP-AZ31B組2、6、24 h細(xì)胞黏附率＞鈦合金組＞AZ31B組，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2細(xì)胞形態(tài)

如圖1所示。3組材料浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞均貼壁良好，大多呈長(zhǎng)梭形，未見明顯的細(xì)胞密度差異。其中CaP-AZ31B組MC3T3-E1細(xì)胞增殖良好，未見明顯細(xì)胞死亡，局部可見部分脫落的鈣磷涂層顆粒。

2.3細(xì)胞增殖活力

如表2所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，3組細(xì)胞增殖活力均逐漸增加（P＜0.05）。其中CaP-AZ31B組培養(yǎng)1、3、5、7 d時(shí)細(xì)胞增殖活力均優(yōu)于AZ31B組（P＜0.05）；3、5 d時(shí)低于鈦合金組（P＜0.05），1、7 d時(shí)與鈦合金組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4細(xì)胞內(nèi)總蛋白量

如表3所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，3組細(xì)胞內(nèi)總蛋白量均逐漸增加（P＜0.05），且在每個(gè)時(shí)相點(diǎn)均表現(xiàn)為CaP-AZ31B組＞鈦合金組＞AZ31B組（P＜0.05）。

表1　不同時(shí)相點(diǎn)3組材料細(xì)胞黏附率比較結(jié)果（±s，n = 6，%）

表1　不同時(shí)相點(diǎn)3組材料細(xì)胞黏附率比較結(jié)果（±s，n = 6，%）

注：AZ31B：鎂合金；CaP-AZ31B：鈣磷涂層鎂合金；與鈦合金組比較，*P＜0.05；與AZ31B組比較，#P＜0.05

分組鈦合金組AZ31B組CaP-AZ31B組F值P值時(shí)相點(diǎn)2 h 27.6±2.1 24.0±2.3*34.2±1.5*#40.125 0.000 6 h 34.9±2.3 29.1±1.9*43.7±1.6*#86.006 0.000 24 h 50.2±2.1 37.3±1.5*62.8±2.0*#276.164 0.000 F值309.070 60.434 561.043 P值0.000 0.000 0.000

圖1　小鼠前成骨細(xì)胞與3組材料浸提液共培養(yǎng)5 d倒置顯微鏡形態(tài)（×100）1A鈦合金組1B鎂合金組1C鈣磷涂層鎂合金組可見部分脫落的鈣磷涂層顆粒

表2　不同時(shí)相點(diǎn)3組細(xì)胞增殖活力（OD值）比較結(jié)果（x-±sn = 6）

表2　不同時(shí)相點(diǎn)3組細(xì)胞增殖活力（OD值）比較結(jié)果（x-±sn = 6）

注：OD：光密度；AZ31B：鎂合金；CaP-AZ31B：鈣磷涂層鎂合金；與鈦合金組比較，*P＜0.05；與AZ31B組比較，#P＜0.05

分組鈦合金組AZ31B組CaP-AZ31B組F值P值時(shí)相點(diǎn)1 d 0.368±0.011 0.291±0.011*0.360±0.018#80.369 0.000 3 d 0.722±0.009 0.548±0.012*0.689±0.020*#220.544 0.000 5 d 0.973±0.021 0.731±0.019*0.918±0.020*#193.966 0.000 7 d 1.192±0.071 0.891±0.082*1.134±0.079#26.718 0.000 F值705.554 294.012 483.505 P值0.000 0.000 0.000

表3不同時(shí)相點(diǎn)3組細(xì)胞內(nèi)總蛋白量比較結(jié)果（x-±s，n = 6，μg/mL）

3　討論

鎂元素是構(gòu)成骨組織中無(wú)機(jī)成分的主要元素，可以促進(jìn)骨組織的再生和骨基質(zhì)的分泌，在人體代謝過(guò)程中擔(dān)負(fù)十分重要的作用［2］。鎂合金是一種可降解的金屬材料，前期研究表明鎂合金具有良好的生物學(xué)效應(yīng)［3］；但降解速度較快，因此導(dǎo)致單純無(wú)涂層鎂合金降解周圍環(huán)境的pH值改變，具有一定的細(xì)胞毒性［4］。為了降低鎂合金的降解速度，減輕其所帶來(lái)的細(xì)胞毒性，學(xué)者們開始嘗試表面改性技術(shù)，如鈣磷涂層、氟涂層等［5-7］，有效延緩了鎂合金的降解。

鈣磷涂層是骨科植入材料最常用的涂層，研究表明，該涂層不但可以延緩鎂合金的降解，而且還能提高其生物相容性能［8-9］。但作為潛在的骨科植入材料，鈣磷涂層鎂合金對(duì)成骨細(xì)胞和成骨環(huán)境究竟有何影響，是值得我們深入研究的問(wèn)題?？紤]到目前骨科常用的植入材料為醫(yī)用鈦合金，因此我們?cè)O(shè)置鈦合金組及未涂層鎂合金組為對(duì)照組，對(duì)比研究鈣磷涂層鎂合金對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)性能的影響。

3.1成骨細(xì)胞黏附性能

黏附是植入材料與成骨細(xì)胞接觸的第一步，它將直接影響成骨細(xì)胞在其表面的增殖及分化。影響?zhàn)じ降囊蛩匕ú牧媳砻娴男蚊?、粗糙度、表面元素成分及金相結(jié)構(gòu)等［10-11］，這些影響因素不是孤立存在的，而是通過(guò)共同作用來(lái)影響細(xì)胞在材料表面的黏附。

3.1.1鎂合金的細(xì)胞黏附性能左林等［12］進(jìn)行鎂合金（含Zn 2%、Mn 0.8%、Ca 1.0%）大鼠成骨細(xì)胞黏附試驗(yàn)，認(rèn)為鎂合金不利于大鼠成骨細(xì)胞黏附。另有學(xué)者證實(shí)鎂合金植入生物體后，可在其表面形成磷酸鹽類物質(zhì)，進(jìn)而周圍會(huì)產(chǎn)生大量成骨細(xì)胞，表明鎂具有良好的骨誘導(dǎo)能力［13］；Yang等［14］將AZ31鎂合金植入動(dòng)物體內(nèi)，亦發(fā)現(xiàn)材料降解后表面有Ca-P物質(zhì)沉積，合金表面的生物活性有所增強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果亦表明，鎂合金植入體內(nèi)后具有良好的生物活性，證實(shí)鎂合金的降解雖然改變了局部的酸堿性能，但機(jī)體存在的動(dòng)態(tài)血液循環(huán)和強(qiáng)大的酸堿緩沖系統(tǒng)，在一定程度上消除了酸堿性能對(duì)其黏附增殖能力的影響。

3.1.2鈣磷涂層鎂合金的細(xì)胞黏附性能Park等［15］的研究結(jié)果證實(shí)鈣磷涂層鎂合金能刺激成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞分化，進(jìn)而促進(jìn)骨折快速愈合；Xu等［16］應(yīng)用磷酸鈣涂層鎂合金進(jìn)行體外成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞黏附和增殖良好；Iskandar等［17］以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為試驗(yàn)細(xì)胞，采用直接接觸試驗(yàn)研究，結(jié)果同樣表明磷酸鈣涂層對(duì)細(xì)胞具有較好的黏附性能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞能夠順利在合金材料表面黏附；隨著黏附時(shí)間的延長(zhǎng)，MC3T3-El細(xì)胞在鈣磷涂層鎂合金表面黏附率逐漸增加，且其黏附率明顯優(yōu)于未涂層鎂合金和鈦合金。其原因可能是鈣磷涂層不僅增加了鎂合金表面的粗糙度和表面積，而且還改變了材料表面的元素組成（從單純的鎂鋁鋅金屬元素到鈣磷元素），同時(shí)弱化了酸堿性能對(duì)細(xì)胞黏附能力的影響。

3.2成骨細(xì)胞增殖活力及細(xì)胞功能

如前所述，在鎂合金表面進(jìn)行鈣磷涂層，可有效延緩鎂合金的降解速度，減少鎂合金周圍環(huán)境的pH值改變，降低細(xì)胞毒性，提高生物相容性。郭磊等［18］通過(guò)體外直接接觸細(xì)胞毒性試驗(yàn)和MTT比色法試驗(yàn)，證實(shí)鈣磷涂層鎂合金材料具有良好的生物相容性，其堿性磷酸酶活性顯著高于Ca-P/ Ti-6Al-4材料組和AZ31B材料組，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化功能具有正性調(diào)節(jié)作用；Lu等［19］的研究結(jié)果也表明，純鎂表面制備β-磷酸三鈣涂層可明顯提高其細(xì)胞相容性；亦有學(xué)者應(yīng)用β-TCP涂層鎂合金進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)到骨形成蛋白-2水平的高表達(dá)［20］。

本研究的細(xì)胞增殖活力檢測(cè)結(jié)果顯示，鈣磷涂層鎂合金具有良好的生物學(xué)性能，對(duì)成骨細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，其細(xì)胞增殖活力顯著優(yōu)于無(wú)涂層鎂合金；進(jìn)一步的倒置顯微鏡觀察顯示，MC3T3-E1細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)大多呈長(zhǎng)梭形，表明鈣磷涂層鎂合金浸提液對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞生長(zhǎng)增殖無(wú)不良影響。在此基礎(chǔ)上，我們針對(duì)鈣磷涂層鎂合金是否影響成骨細(xì)胞功能進(jìn)行了相關(guān)研究，細(xì)胞內(nèi)總蛋白結(jié)果表明鈣磷涂層鎂合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞其胞內(nèi)總蛋白量顯著高于鎂合金組及鈦合金組，提示鈣磷涂層對(duì)于成骨細(xì)胞功能具有一定的促進(jìn)作用。

綜上所述，鈣磷涂層鎂合金可增強(qiáng)小鼠成骨細(xì)胞的黏附能力和增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)總蛋白的表達(dá)，具有良好的生物相容性。但本研究為體外實(shí)驗(yàn)，其植入體內(nèi)后對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化及成骨分化基因的表達(dá)有無(wú)影響，還有待進(jìn)一步的研究。

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短篇論著

The influence of magnesium alloy w ith calcium phosphate coating（CaP-AZ31B）on the biological properties of m ouse osteoblasts

ZHANG Tao*，XIA Hong，YIN Qingshui，LI Mei，ZHANG Yu，YANG Xiaoming，LAN Guobo. *Hospital of Orthopaedics，Orthopaedic Trauma Institute of PLA，the Key Lab of Trauma & Tissue Repair of Tropical Area of PLA，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou，Guangdong 510010，China

【Abstract】Objective To study the influence of magnesium alloy w ith calcium phosphate coating （CaP-ZA31B）on the biological properties of mouse osteoblast precursor cells（MC3T3-E1）. Methods In this study，they were divided into CaP-ZA31B group and two control groups［magnesium alloy（AZ31B）group andbook=37,ebook=37titanium alloy group］. Adhesion rates of MC3T3-E1 cells on the surface of the materials in 3 groups 2，6，and 24 hours after co-culture were observed；Cell morphology of MC3T3-E1 1，3，5，7 days after co-culture w ith leach liquor of materials in 3 groups were determ ined by using inverted m icroscope，and w ith CCK assay and BCA assay，MC3T3-E1 proliferation activities were detected，at the same time，total protein of MC3T3-E1 was also calculated in each group. Results As time of co-culture went by，adhesion rate，proliferation viability as well as total protein of MC3T3-E1 in 3 groups all increased significantly（P＜0.05）. At different time-points，cell adhesion rate of MC3T3-El cell in CaP-AZ31B group＞titanium alloy group＞AZ31B group（P＜0.05）. MC3T3-E1 cell in leach liquor of material in each group showed good attachment to the wall，which most of cells presented fusiform. Cell proliferation viability in CaP-AZ31B groups was better than that in AZ31B group at different time-point（P＜0.05）；As for total protein of MC3T3-E1，CaP-AZ31B group＞titanium alloy group＞AZ31B group（P＜0.05）. Conclusion Compared to AZ31B or titanium alloy，CaP-AZ31B has better biocompatibility w ith mouse osteoblast precursor cells because the material could enhance cell adhesion and proliferation viability，and improve the expression level of intracellular total protein more significantly.

【Key words】Magnesium；Alloys；Calcium phosphates；Coating；Biocompatible materials；M ice；Osteoblasts；Cells，cultured；Adhesion；Proliferation

中圖分類號(hào)：R329.24，R336

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-666X（2016）02-098-06

DOI：10.3969/j.issn.1674-666X.2016.02.006

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30872642）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020215025）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015A030313607）；軍隊(duì)“十二五”計(jì)劃課題重點(diǎn)項(xiàng)目（BWS11C065）；廣東省藥學(xué)會(huì)研究基金（2015ZT06）

通信作者：夏虹，E-mail：gzxiahong2@126.com

Corresponding author：XIA Hong，E-mail：gzxiahong2@126.com

收稿日期：（2016-01-12；修回日期：2016-02-28）（本文編輯：白朝暉）