茶條槭葉總酚的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

趙　巖，于　婷，蔡恩博，劉雙利，楊　鶴，張連學(xué)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

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茶條槭葉總酚的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

趙巖，于婷，蔡恩博，劉雙利，楊鶴，張連學(xué)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

[摘要]【目的】 研究茶條槭葉總酚的提取工藝，并對茶條槭葉總酚提取物的抗氧化活性進行評價，為茶條槭葉的開發(fā)利用提供依據(jù)?！痉椒ā?以乙醇為溶劑, 以總酚提取率為考察指標，采用超聲輔助提取法處理茶條槭葉，先通過單因素試驗確定乙醇體積分數(shù)、超聲提取時間和液固比的適宜范圍，再應(yīng)用中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法篩選最佳提取條件；最后采用鐵離子還原法、DPPH自由基清除法測定茶條槭葉提取物的抗氧化能力?！窘Y(jié)果】 超聲波輔助提取茶條槭葉總酚的最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)55%，超聲提取時間46 min，液固比246 mL/g，在此條件下茶條槭葉總酚提取率為 (10.95±0.22)%。茶條槭葉總酚提取液對鐵離子還原的IC50為 (0.157±0.005) mg/mL，對DPPH自由基的IC50為 (0.073±0.003) mg/mL?！窘Y(jié)論】 超聲提取法可以避免總酚在較高溫度下的分解，且優(yōu)化后提取率較高，可以用于茶條槭葉總酚的提取；茶條槭葉提取液具有較高的抗氧化活性。

[關(guān)鍵詞]茶條槭葉；總酚；超聲提?。恢行慕M合設(shè)計；響應(yīng)面分析；抗氧化活性

茶條槭(AcerginnalaMaxim)為槭樹科槭樹屬的落葉灌木或小喬木，主要分布在中國、朝鮮、日本、俄羅斯、蒙古等國[1]。茶條槭樹形優(yōu)美，枝葉濃密，秋葉猩紅色，因此是優(yōu)良的園林綠化樹種[2]；從茶條槭葉中可提取沒食子酸[3-4]，其嫩葉還可制成茶葉，具有生津止渴、退熱明目之功效[5]，因此茶條槭還具有較大藥用價值和經(jīng)濟價值[6]。

植物酚酸類物質(zhì)廣泛存在于植物組織中[7]，許多研究資料顯示，總酚具有較強的抗氧化活性及明顯的抑菌、抑腫瘤、抗衰老和抗心血管疾病的作用[8-10]。許多學(xué)者對植物中的酚類化合物進行了研究[11-16]，但有關(guān)茶條槭葉中總酚提取方法及其抗氧化活性的研究卻鮮有報道。為此，本研究擬采用響應(yīng)面分析法[17-19]對茶條槭葉中總酚的提取工藝進行優(yōu)化，并測定其體外抗氧化能力[20-21]，旨在為茶條槭葉的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料供試茶條槭葉采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物園，陰干粉碎后過孔徑0.18 mm(80目)篩備用。沒食子酸為北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品，福林酚試劑為合肥博美生物產(chǎn)品，1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品，其他試劑均為分析純。

1.1.2主要試驗儀器港威超聲儀，超聲頻率40 kHz，超聲功率2 000 W，由江蘇省張家港市港威超聲電子有限公司生產(chǎn)；LD-34流水式中藥粉碎機，由中國溫嶺市大海藥材器械廠生產(chǎn)；百靈LA114型電子天平，由常熟市百靈天平儀器有限公司生產(chǎn)；UV-1800紫外可見分光光度計，由上海美譜達儀器有限公司生產(chǎn)；HH-W-600型數(shù)顯恒溫水箱，由金壇市江南儀器廠生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1對照品溶液的制備取沒食子酸適量，精密稱定，加蒸餾水制成0.25 mg/mL的溶液。

1.2.2供試品溶液的制備取同一批次的茶條槭葉0.5 g，精密稱定，按一定的液固比加入一定體積分數(shù)的乙醇-水溶液，超聲提取一定時間，過濾，作為供試品溶液。

1.2.3總酚含量的測定采用比色法測定茶條槭葉提取液中的總酚含量：精密吸取供試品溶液與對照品溶液各0.5 mL，置于25 mL量瓶中，加入福林酚試劑2.5 mL、碳酸鈉溶液(75 g/L)2 mL，于50 ℃水浴加熱5 min，冷卻后用蒸餾水定容。然后在760 nm處測定吸光度值。運用外標一點法計算茶條槭葉總酚含量(提取率)。

1.2.4茶條槭葉總酚提取的單因素試驗采用超聲輔助提取法提取茶條槭葉總酚，考察乙醇體積分數(shù)(0，20%，40%，60%，80% 和 95%)、超聲提取時間(5，10，20，30，40 和 50 min)、液固比(20，50，100，150，200，250和300 mL/g)3個因素對茶條槭葉總酚提取率(同1.2.3節(jié)的總酚含量)的影響。

1.2.5茶條槭葉總酚提取的中心組合設(shè)計試驗為了分析各因素及其交互作用對茶條槭葉中總酚提取率的影響，得到最佳提取工藝，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以茶條槭葉中總酚提取率為指標，進行了中心組合設(shè)計試驗。中心組合設(shè)計試驗中各因素及其水平詳見表1。

表 1　提取茶條槭葉總酚的中心組合設(shè)計試驗的因素與水平

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SAS 9.1.3軟件對試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，建立數(shù)學(xué)模型，用嶺脊分析優(yōu)化提取工藝，并采用ORIGIN 8軟件作圖。

1.2.7茶條槭葉總酚的抗氧化活性評價(1)對鐵離子的還原能力。采用比色法測定茶條槭葉總酚對三價鐵離子的還原能力。將提取液(響應(yīng)面最優(yōu)條件下)稀釋成6個質(zhì)量濃度梯度(0.005～1 mg/mL)的樣品溶液，每個梯度分別取樣品溶液2.5 mL，加入2.5 mL pH 6.6磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/mL)和2.5 mL 質(zhì)量分數(shù)1% K3Fe(CN)6，混合均勻，于50 ℃反應(yīng)20 min，放涼，再加入2.5 mL 質(zhì)量分數(shù)10%三氯乙酸。從上述混合液中取出2.5 mL放入新的刻度試管中，加入2.5 mL蒸餾水，0.5 mL 質(zhì)量分數(shù)0.1% FeCl3，用體積分數(shù)95%乙醇作為空白對照，在700 nm處測量吸光度值。對照品選用2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、維生素C(Vc)。運用ORIGIN 8軟件計算半抑制率(IC50值)。

(2)DPPH自由基的清除能力。采用比色法[22]測定茶條槭葉總酚對DPPH·的清除作用。將提取液(響應(yīng)面最優(yōu)條件下)稀釋成6個質(zhì)量濃度梯度(0.005～1 mg/mL)的樣品溶液。向a具塞試管中加入3 mL DPPH·溶液(0.04 mg/mL)、3 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液，向b具塞試管中加入3 mL DPPH·溶液(0.04 mg/mL)、3 mL不同質(zhì)量濃度(1，0.5，0.1，0.05，0.01，0.005 mg/mL)樣品溶液，向c具塞試管中加入3 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液(與b具塞試管一一對應(yīng))、3 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液，搖勻，室溫避光靜置30 min，用體積分數(shù)95%乙醇作參比溶液，在515 nm 處測量吸光度值。對照品選用BHT、Vc。樣品對DPPH·的清除率(E)按如下公式計算。運用ORIGIN 8軟件計算IC50值。

式中：Aa是a具塞試管的吸光度值，Ab是b具塞試管的吸光度值，Ac是c具塞試管的吸光度值。

2結(jié)果與分析

2.1提取茶條槭葉總酚的單因素試驗

2.1.1乙醇體積分數(shù)對提取率的影響固定超聲提取時間為30 min，液固比為200 mL/g，乙醇體積分數(shù)對茶條槭葉總酚提取率的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，在乙醇體積分數(shù)為0～60%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，茶條槭葉總酚提取率隨之增加，乙醇體積分數(shù)為60%時，總酚提取率最高；繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)，總酚提取率有所下降?？紤]到實際生產(chǎn)中乙醇回收的耗能問題，盡可能選擇高體積分數(shù)乙醇進行提取，因此將乙醇體積分數(shù)考察范圍定為20%～80%。

2.1.2超聲提取時間對提取率的影響固定乙醇體積分數(shù)為60%，液固比為200 mL/g，超聲提取時間對茶條槭葉總酚提取率的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，在超聲提取時間為5～40 min時，隨著超聲提取時間的延長，茶條槭葉總酚提取率隨之提高，在40 min之后總酚提取率有所下降，因此將超聲提取時間考察范圍定為20～50 min。

圖 1　乙醇體積分數(shù)對茶條槭葉總酚提取率的影響

2.1.3液固比對提取率的影響固定乙醇體積分數(shù)為60%，超聲提取時間為30 min，液固比對茶條槭葉總酚提取率的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，在液固比為20～200 mL/g時，隨著液固比的增加，茶條槭葉總酚提取率隨之提高；從200 mL/g至300 mL/g時，總酚提取率先保持平穩(wěn)后略微下降，因此將液固比考察范圍定為100～300 mL/g。

圖 3　液固比對茶條槭葉總酚提取率的影響

2.2提取茶條槭葉總酚的中心組合設(shè)計-響應(yīng)面分析

2.2.1試驗方案及其結(jié)果提取茶條槭葉總酚的中心組合設(shè)計試驗方案及其結(jié)果詳見表2，共進行了17組獨立試驗。

2.2.2響應(yīng)面分析采用SAS 9.1.3軟件的RSREG(二次響應(yīng)面回歸模型)程序?qū)Ρ?中的試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，經(jīng)二次回歸擬合，得到回歸模型參數(shù)估計值(表3)、方差分析表(表4)和嶺脊分析表(表5)。由表3可知，回歸方程為：

從表4可見，總模型、線性項、平方項的P<0.01，表明總模型和方程的線性項、平方項對總酚提取率的影響極顯著；而方程的交互項P>0.05，表明其對提取率的影響不顯著。相關(guān)性分析中，總模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.911 0，表明回歸方程對總酚提取率的預(yù)測值與實測值有較好的相關(guān)性。失擬項檢驗中，P>0.05，表明失擬性不顯著，該回歸方程無失擬因素存在，回歸方程與實測值能較好擬合。

表 2　提取茶條槭葉總酚的中心組合設(shè)計試驗方案及其結(jié)果

對回歸方程的嶺脊分析結(jié)果(表5)表明，方程預(yù)測的茶條槭葉中總酚最佳提取條件為：乙醇體積分數(shù)55%，超聲提取時間46 min，液固比246 mL/g；在該條件下，總酚的提取率為11.02%。為驗證模型的有效性，對上述最佳提取條件進行了驗證試驗，結(jié)果平均提取率為(10.95±0.22)%，試驗值與預(yù)測值接近。進一步說明模型的可行性。

為了更直觀地體現(xiàn)各因素對茶條槭葉總酚提取率的影響，運用ORIGIN 8 軟件繪制響應(yīng)面圖形，結(jié)果見圖4～6。

從圖4可以看出，當液固比不變時，總酚提取率隨著超聲提取時間的增加呈先略微升高后下降的趨勢；當超聲提取時間不變時，總酚提取率隨著液固比的增加呈現(xiàn)先升高后平緩下降的趨勢。從等高線圖和響應(yīng)面的角度可以判斷出，液固比對響應(yīng)值的影響大于超聲提取時間。

表 3　提取茶條槭葉總酚的中心組合設(shè)計-響應(yīng)面分析回歸模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果

注：*P<0.05，表示顯著；**P<0.01，表示極顯著；在P<0.2水平上拒絕假設(shè)。下同。

Note:*P<0.05,significant;**P<0.01,very significant;assumption was rejected inP<0.2 level.The same below.

表 4　提取茶條槭葉總酚的中心組合設(shè)計-響應(yīng)面分析回歸模型的方差分析

表 5　提取茶條槭葉總酚的中心組合設(shè)計-響應(yīng)面分析回歸模型的嶺脊分析

從圖5可以看出，當液固比不變時，總酚提取率隨著乙醇體積分數(shù)的增加呈先上升后下降的趨勢；當乙醇體積分數(shù)不變時，總酚提取率隨著液固比的增加呈先上升后平緩下降的趨勢。從等高線圖和響應(yīng)面的角度可以判斷出，液固比對響應(yīng)值的影響略大于乙醇體積分數(shù)。

從圖6可以看出，當超聲提取時間不變時，總酚提取率隨著乙醇體積分數(shù)的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；當乙醇體積分數(shù)不變時，總酚提取率隨著超聲提取時間的增加呈先升高后略微下降的趨勢。從等高線圖和響應(yīng)面的角度可以判斷出，乙醇體積分數(shù)對響應(yīng)值的影響略大于超聲提取時間。

綜上所述，液固比對總酚得率的影響最大，乙醇體積分數(shù)次之，超聲提取時間的影響較小。

圖 4　超聲提取時間和液固比對茶條槭葉總酚提取率影響的等高線圖(左)和

圖 5　乙醇體積分數(shù)和液固比對茶條槭葉總酚提取率影響的等高線圖(左)和

圖 6　乙醇體積分數(shù)和超聲提取時間對茶條槭葉總酚提取率影響的等高線圖(左)和

2.3茶條槭葉總酚的抗氧化能力

2.3.1對鐵離子的還原能力三價鐵離子在700 nm處有最大吸收峰，當抗氧化劑與Fe3+在pH 6.6的條件下反應(yīng)還原成Fe2+，溶液由黃色轉(zhuǎn)化為綠色，且其顏色轉(zhuǎn)化程度越深表示抗氧化能力越強，因而可用比色法進行定量分析，從而評價樣品的抗氧化能力。由圖7可知，茶條槭葉提取液(響應(yīng)面最優(yōu)條件下)對三價鐵離子具有很強的還原能力，其還原能力隨提取液質(zhì)量濃度的增加而不斷增強，IC50為(0.157± 0.005) mg/mL。在質(zhì)量濃度均為0.157 mg/mL時，其鐵離子還原能力分別是BHT、Vc的42.0%和52.7%。

2.3.2對DPPH自由基的清除能力DPPH 自由基在515 nm處有最大吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色，當存在有自由基清除能力的抗氧化劑時，由于抗氧化劑與DPPH·的單電子配對，繼而使其吸收逐漸消失，且其褪色程度與接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用比色法進行定量分析來檢測自由基的清除情況，從而評價樣品的抗氧化能力[23]。由圖8可知，茶條槭葉提取液(響應(yīng)面最優(yōu)條件下)對DPPH自由基具有很強的清除作用，在較低的質(zhì)量濃度下即有較高的清除效果，且隨提取液質(zhì)量濃度的增加而不斷增強，IC50為 (0.073±0.003) mg/mL。在質(zhì)量濃度均為0.073 mg/mL時，其清除DPPH自由基的能力分別是BHT、Vc的14.5%和44.3%。

圖 7　茶條槭葉總酚對鐵離子的還原作用

3結(jié)論

本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化茶條槭葉總酚的提取工藝，結(jié)果表明，液固比對總酚得率的影響最大，乙醇體積分數(shù)次之，超聲提取時間的影響較小，最佳工藝條件為: 液固比246 mL/g，乙醇體積分數(shù)55%，超聲提取時間46 min。驗證試驗結(jié)果表明，茶條槭葉總酚的得率為(10.95±0.22)%，回歸模型擬合度高，可用于優(yōu)化茶條槭葉總酚的提取工藝條件，具有實用價值。

本試驗通過對茶條槭葉總酚提取液(響應(yīng)面最優(yōu)條件下)抗氧化性的研究表明：茶條槭葉原藥材具有較強的抗氧化能力，茶條槭葉總酚提取液對鐵離子還原力的IC50為(0.157±0.005) mg/mL，對DPPH自由基的IC50為(0.073±0.003) mg/mL。由于茶條槭葉的總酚含量較高，有較好的抗氧化能力，且為天然提取物，使用安全，因此可以作為新型的抗氧化劑，具有較好的開發(fā)潛力。

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Optimization of total phenol extraction from leaves ofAcerginnalaand its antioxidant activity

ZHAO Yan,YU Ting,CAI En-bo,LIU Shuang-li,YANG He,ZHANG Lian-xue

(CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

Abstract:【Objective】 This paper investigated the extraction process of total phenol from Acer ginnala leaves and evaluated its antioxidant activity to provide basis for the development and utilization of A.ginnala leaves.【Method】 A.ginnala leaves were processed using ultrasonic assisted method with ethanol as the solvent and total phenol extraction yield as examining index.First,ethanol volume fraction,suitable range of ultrasonic extraction time,and solid-liquid ratio were determined by single factor experiments.Then,central composite design and response surface analysis method were applied for screening the best extraction conditions.At last,the iron reduction method and DPPH free radical scavenging assay were adopted to determine antioxidant capacity of A.ginnala leaves extract.【Result】 The optimum conditions for ultrasonic assisted extraction were ethanol volume fraction 55%,extraction time 46 min,and liquid-solid ratio 246 mL/g with the optimal total phenol yield of (10.95±0.22)%.The iron ions reduction IC50of extract was (0.157±0.005) mg/mL and that for DPPH was (0.073±0.003) mg/mL.【Conclusion】 Ultrasonic extraction method can avoid the decomposition of total phenol under high temperature,and had high yield after optimization.Thus,it can be used for extraction of total phenol from A.ginnala leaves,which had high antioxidant activity.

Key words:leaves of Acer ginnala;total phenolic;ultrasonic extraction;central composite design;response surface analysis;antioxidant activity

[文章編號]1671-9387(2016)01-0177-08

[中圖分類號]R284.2

[文獻標志碼]A

[作者簡介]趙巖(1979-)，男，吉林長春人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然藥物化學(xué)成分與生物活性研究。[通信作者]張連學(xué)(1955-)，男，吉林長春人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事藥用植物栽培與加工研究。E-mail：zlx863@163.com

[基金項目]國家科技支撐計劃項目(2011BAI03B01)；國家公益性行業(yè)科研專項(201303111)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20126046,YYZX201258,20140204013YY)；國家自然科學(xué)基金項目(31000154)

[收稿日期]2014-04-15

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.026

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.052.html

E-mail：zhyjlu79@163.com