野生大豆根瘤GmGS1γ基因序列分析及原核表達(dá)

楊美英 岳勝天 韓紅 孫合美 劉晶晶 盧冬雪

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，長春 130118）

YANG Mei-ying YUE Sheng-tian HAN Hong SUN He-mei LIU Jing-jing LU Dong-xue

（College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118）

野生大豆根瘤GmGS1γ基因序列分析及原核表達(dá)

楊美英 岳勝天 韓紅 孫合美 劉晶晶 盧冬雪

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，長春 130118）

旨在明確大豆谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）基因家族各成員的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及功能。利用同源克隆的方法從野生大豆根瘤克隆GmGS1γ基因。生物信息學(xué)分析表明，ORF為1 071 bp，與大豆GS1γ（AF363022.1）部分序列的相似性為100%，與序列號為X81700.1相似性為99%。該序列具備植物GS的兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，GS beta-Grasp功能區(qū)（17-97 aa）和GS催化功能區(qū)（103-350 aa）。系統(tǒng)發(fā)生樹表明該基因編碼的GS可能屬于胞質(zhì)2型同工酶。該基因可以在大腸桿菌DE3.0中表達(dá)，蛋白分子量為44 kD。

野生大豆；谷氨酰胺合成酶（GS）；原核表達(dá)；序列分析

植物根系從土壤中吸收的NO3-，通過莖、葉柄運(yùn)往葉片，在葉片中硝酸還原酶等的作用下轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮，再在谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）的作用下轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺（Gln），進(jìn)入氮代謝。除此以外，根瘤中向上運(yùn)輸?shù)孽ｋ逶谌~片中也代謝形成NH4+，經(jīng)過GS 轉(zhuǎn)化后進(jìn)入氮代謝［1］。因此，GS在植物氮代謝中起著關(guān)鍵的作用，是植株氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶［2］。

GS以多種形式存在于植物中，高等植物的種子、葉、根、根瘤和果實(shí)等器官中分布著多種GS的同工酶，GS的不同功能由不同的GS同工酶承擔(dān)［3］。在葉片中，GS2的功能是通過硝酸鹽還原和光呼吸過程來同化氨［4］；根中GS1直接從土壤中吸收氨或者NO3-［5］；胚中，吸收分解發(fā)芽期儲存的含氮物釋放的氨［6］；根瘤中GS主要是快速的吸收氮，固定細(xì)菌侵染的細(xì)胞排泄到植物中的氨［7］。GS 的分子生物學(xué)研究始于1983 年，從藍(lán)細(xì)菌克隆到GS 并完全測序分析。許多植物，如大麥［8］、水稻［9］、豌豆［10］等的GS cDNA已被克隆。

大豆作為一種重要的糧-油兼用作物，籽粒蛋白質(zhì)含量明顯高于玉米、水稻等作物［11］，而且可以形成豆科植物-根瘤菌共生固氮體系。高蛋白野生大豆ZYD01251蛋白質(zhì)含量可以達(dá)到53%以上，具有較強(qiáng)的氮素利用與貯藏機(jī)制。而且作者在前期的研究中發(fā)現(xiàn)高蛋白野生大豆根瘤衰老較慢，根瘤內(nèi)氮代謝物含量豐富，生育后期仍具有較強(qiáng)的酰脲合成與運(yùn)輸能力是形成該類型大豆籽粒高蛋白質(zhì)含量的原因之一［12］。 為了進(jìn)一步明確根瘤的生長發(fā)育及其基因表達(dá)對野生大豆蛋白質(zhì)含量的影響，本研究從野生大豆根瘤中克隆GmGS1γ基因序列，對該序列利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行預(yù)測并構(gòu)建pET-28a-GmGS1γ原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白，旨在進(jìn)一步認(rèn)識野生大豆GS基因家族各成員的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其在氮素代謝過程中的功能，明確不同GS同工酶在植物氨同化過程中的貢獻(xiàn)以及為研究植物氮代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與試劑 大腸桿菌菌株DH5α、BL21（DE3）及載體pET28a（+）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。Easy ScriptTMFirst-strand cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和pMD18-T載體試劑盒以及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購于TaKaRa公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 植物材料 本實(shí)驗(yàn)所用大豆材料為高蛋白野生大豆ZYD01251（原產(chǎn)于吉林省東遼縣，生育期125 d，蛋白含量53.0%）。

1.2 方法

1.2.1 根瘤樣品的采集及RNA的提取 將吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆試驗(yàn)田土壤裝入直徑為20 cm的塑料盆，種植野生大豆ZYD01251，每盆3株。收集45 d苗齡的大豆根瘤，用蒸餾水將根瘤沖洗干凈，快速用液氮處理后，-80℃冰箱保存。Trizol法提取大豆根瘤總RNA，752N紫外分光光度計(jì)測定OD260和OD280，選擇OD260/OD280介于1.7-2.0 的樣品，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。1.2.2 GmGS1γ基因的PCR擴(kuò)增 以野生大豆根瘤cDNA為模板，PCR擴(kuò)增GmGS1γ基因。所用引物根據(jù)GenBank發(fā)表的大豆GmGS1γ序列（X81700.1）進(jìn)行設(shè)計(jì)。GmGS1γF：5'-AAGAGTCTCCGCTGAAC -3'；GmGS1γR：5'-AACAGGCGAGGTAGTCA-3'。引物合成與擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定均由上海生工生物工程有限公司完成。

將野生大豆GmGS1γ基因測序結(jié)果進(jìn)行分析。采用GenBank DNA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比較。采用NCBI在線軟件對GmGS1γ蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）。搜索NCBI蛋白庫里所有大豆GS的全序列，利用DNAMAN軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.2.3 原核表達(dá)載體pET-28a-GmGS1γ的構(gòu)建與鑒定 以測序?yàn)殛栃缘闹亟M質(zhì)粒pMD18-T-GmGS1γ為模板，兩端具有Xho I/Sal I酶切位點(diǎn)的引物GmGS1-γF：5'-CGAGCTCATGTCGTTACTCTCCGATCTTA-3'和GmGS1γR：5'-CCGCTCGAGCGTTGCTTATGGTTTCC AAAG-3'（下劃線部分為酶切位點(diǎn)）進(jìn)行PCR，獲得兩端分別帶有Xho I和Sac I酶切位點(diǎn)的目的片段。將目的片段和pET28a（+）分別用Xho I和Sac I雙酶切，凝膠回收并連接。連接產(chǎn)物42℃熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。PCR及Xho I/Sac I雙酶切驗(yàn)證為陽性的克隆送上海生工測序。

1.2.4 重組質(zhì)粒pET-28a-GmGS1γ在大腸桿菌BL21（DE3）體內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定為陽性的BL21（pET-28a-GmGS1γ）挑取單菌落到LB液體培養(yǎng)基中（含Kan），37℃，160 r/min，過夜培養(yǎng)。以1%的接種量將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到含有Kan抗性的 LB液體培養(yǎng)基中，37℃，160 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6。加入IPTG使其終濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)2 h和4 h，各取1 mL菌液，10 000×g，離心10 min收集菌體。將收集到的菌體加入100 μL樣品溶解液充分混勻。100℃處理10 min，裂解菌體細(xì)胞。12 000 r/min離心10 min，收集上清，上樣20 μL，采用12%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 根瘤總RNA的提取及GmGS1γ基因的克隆

為了克隆目的基因，從野生大豆的大豆根瘤中提取總RNA?？俁NA提取及GmGS1γ基因擴(kuò)增結(jié)果（圖1）顯示，RNA提取效果理想，可以看到清晰的3條帶。提取的RNA可以進(jìn)行下一步的RT-PCR實(shí)驗(yàn)。以反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在約1 000 bp處有一條清晰的特異性片段，大小與預(yù)測值相符。用DNA凝膠回收試劑盒將擴(kuò)增出的片段進(jìn)行回收，并將回收片段克隆到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞。

圖1 大豆根瘤總RNA提取及GmGS1γ基因克隆

2.2 GmGS1γ基因的序列分析

對構(gòu)建成功的pMD18-T-GmGS1γ重組質(zhì)粒中的目的片段進(jìn)行測序。結(jié)果表明，序列全長1 215 bp。將該序列利用GenBank中BLAST進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與大豆GS1γ（AF363022.1）部分序列的相似性為100%，與引物設(shè)計(jì)時(shí)選擇的GS參考序列（X81700.1）相似性為99%。利用NCBI的在線結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件對序列的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（圖2）表明，這一序列包含一個(gè)1 071 bp編碼356 aa的ORF，為GS的編碼區(qū)，這個(gè)蛋白包含了一個(gè)GS beta-Grasp功能區(qū)（17-97 aa）和GS催化功能區(qū)（103-350 aa）。這些功能區(qū)在植物的GS中是保守的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，從而證實(shí)GmGS1γ基因克隆成功。2.3 大豆各類GS蛋白全序列系統(tǒng)發(fā)生樹

從NCBI蛋白庫里共搜索到21條包括GS同工酶和GS受體蛋白的全序列，與GmGS1γ基因所編碼的蛋白序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建。結(jié)果（圖3）顯示，不同類的GS形成不同的簇。以胞質(zhì)GS同工酶1型為主形成的第①簇，以GS前體為主形成的第②簇，而GmGS1γ基因序列所編碼的GS分在了第③簇中，并且與序列號為CAA57346（核酸序列為X81700）的谷氨酸氨連接酶及序列號為AAC97935的根瘤特異性GS相鄰，與序列號為XP_003519325的胞質(zhì)GS 2型同工酶分成一個(gè)小的分支。

圖2 GmGS1γ基因編碼序列結(jié)構(gòu)域及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 原核表達(dá)載體pET-28a-GmGS1γ的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pMD18-T-GmGS1γ為模板，目的片段GmGS1γ基因ORF的擴(kuò)增結(jié)果（圖4-A）顯示，大小約為1 000 bp。將該片段回收，限制性內(nèi)切酶消化后，與pET-28a（+）進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒pET-28-GmGS1γ，酶切結(jié)果如圖4-B所示。酶切獲得的片段與PCR擴(kuò)增片段大小一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖3 大豆GS系統(tǒng)發(fā)生樹

圖4 GmGS1γ基因ORF的PCR（A）與酶切（B）結(jié)果

2.5 GmGS1γ基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-28-GmGS1γ轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21中，同時(shí)以原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21中作為對照。利用12%的SDS-PAGE對經(jīng)1.0 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)2 h和4 h的菌液進(jìn)行分析。結(jié)果（圖5）顯示，兩個(gè)時(shí)間段的菌液均在約44.0 kD處明顯出現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，說明該基因在菌株BL21中成功表達(dá)，而且4 h時(shí)的表達(dá)量明顯高于2 h時(shí)的表達(dá)水平。

圖5GmGS1γ蛋白的表達(dá)

3 討論

根瘤中的根瘤菌（類菌體）利用宿主植物體提供的能量和內(nèi)環(huán)境，將空氣中的N2還原為氨，供宿主植物利用，形成了自然界效率最高的共生固氮作用［13］。1988年米山忠克［14］研究認(rèn)為，根瘤固氮首先在類菌體中將N2還原為NH4+，然后在GS的作用下合成Gln，再在一系列酶的作用下形成酰脲向地上部運(yùn)輸。GS是高等植物氮素代謝的關(guān)鍵酶［15］。大豆GS1基因家族存在α、β、γ 3個(gè)組分［16，17］，其中子葉和幼根中以α為主；雖然β是組成型表達(dá)，但其卻在固氮根瘤中表達(dá)水平較高；γ1表現(xiàn)為根瘤特異表達(dá)［5］，而γ2則在根瘤、子葉和花中被檢測到［18］。王曉波等［19］研究發(fā)現(xiàn)，大豆根瘤中存在4個(gè)豆科植物特有的GS1基因。本研究從高蛋白野生大豆ZYD01251根瘤中成功克隆了GmGS1γ基因，BLAST結(jié)果顯示該基因序列與大豆GS1γ（AF363022.1）的相似性為100%。而且該序列編碼的氨基酸序列具有植物GS中保守的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，GS beta-Grasp功能區(qū)和GS催化功能區(qū)，說明本實(shí)驗(yàn)獲得的序列具有編碼大豆根瘤中GS的特征。而且從大豆GS系統(tǒng)發(fā)生樹分析，該基因編碼的氨基酸序列可能屬于胞質(zhì)GS 2型同工酶。

高等植物中GS全酶均為八聚體，每個(gè)亞基分子量為38-45 kD［2］。本實(shí)驗(yàn)中DE3.0（pET-28-GmGS1γ）表達(dá)的目的蛋白約為44 kD，該蛋白的大小符合GS亞基分子量的范圍。

4 結(jié)論

從野生大豆根瘤中克隆到ORF為1 071 bp的GmGS1γ序列，生物信息學(xué)分析表明，該序列具備植物GS的兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，GS beta-Grasp功能區(qū)（17-97 aa）和GS催化功能區(qū)（103-350 aa）。系統(tǒng)發(fā)生樹表明該基因編碼的GS可能屬于胞質(zhì)2型同工酶。該基因可以在大腸桿菌DE3.0中表達(dá)，蛋白分子量為44 kD。

［1］李姚, 馬春梅, 龔振平. 春大豆谷氨酰胺合酶（GS）活性動(dòng)態(tài)的研究［J］. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 6：729-732.

［2］馮萬軍, 竇晨, 牛旭龍, 等. 玉米谷氨酰胺合成酶基因家族的生物信息學(xué)分析［J］. 玉米科學(xué), 2015, 23（1）：51-57.

［3］韓娜, 葛榮朝, 趙寶存, 等. 植物谷氨酰胺合成酶研究進(jìn)展［J］.河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2004, 28（4）：407-423.

［4］Hanne CT, Dennis E, Inge SM, et al. Cytosolic glutamine synthetase：a target for improvement of crop nitrogen use efficiency［J］. Trends in Plant Science, 2014, 19（10）：656-663.

［5］Lea PJ, Ireland RJ. Nitrogen metabolism in higher plants［J］. Annual Review of Plant Physiology, 1999：1-47.

［6］Swarup R, Bennett MJ, Cullimore JV. Expression of glutaminesynthetase genes in cotyledons of germinating Phaseolus vulgaris L.［J］. Planta, 1990, 183（1）：51-56.

［7］Mariangela H, Glaciela K. Regulation of N fixation and NO-23/NH4+assimilation in nodulated and N-fertilized Phaseolus vulgaris L. exposed to high temperature stress［J］. Environmental and Experimental Botany, 2014, 98：32-39.

［8］Freeman J, Marquez A, Wallsgrove RM, et al. Moleular analysis of barley mutants deficient chloroplast glutamine synthetase［J］. Plant Mol Biol, 1990, 14（3）：297-311.

［9］Li MG, Villemur R, Hussey PJ, et al. Differential expression of six glutamine synthetase genes in Zea mays［J］. Plant Molecular Biology, 1993, 23（2）：401-407.

［10］Tingey SV, Tsai FY, Edwards JW, et al. Chloroplast and cytosolic glutamine synthetase are encoded by homologous nuclear genes which are differentially expressed in vivo［J］. J Biol Chem, 1988, 263（20）：9651-9657.

［11］李喜煥, 常文鎖, 張彩英. 中國大豆磷素營養(yǎng)及磷高效品種篩選最新進(jìn)展［J］. 大豆科學(xué), 2011, 30（2）：322-327.

［12］楊美英, 王乾欽, 趙洪錕, 等. 不同蛋白質(zhì)含量大豆結(jié)瘤特性與根瘤氮代謝物含量的比較分析［J］. 中國油料作物學(xué)報(bào), 2011, 33（5）：492-498.

［13］王彥章, 俞冠翹, 沈善炯, 等. 大豆早期結(jié)瘤素基因enod2B啟動(dòng)子在水稻中的表達(dá)受結(jié)瘤因子誘導(dǎo)［J］. 科學(xué)通報(bào), 2004, 3：238-244.

［14］董鉆. 大豆產(chǎn)量生理［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000：97-105.

［15］于瑤, 張漢堯, 杜建偉. 高等植物谷氨酰胺合成酶基因的研究進(jìn)展［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 44（4）：15-19.

［16］Kevin JM, Jose LO, Champa SG. Cytosolic glutamine synthetase in soybean is encoded by a multigene family, and the members are regulated in an organ-specific and developmental manner［J］. Plant Physiology, 2002, 128：182-193.

［17］Peterman TM, Goodman HM. The glutamine synthetase gene family of Arabidopsis thaliana：light-regulation and differential expression in leaves, roots and seeds［J］. Mol Gen Genet, 1991, 330：145-154.

［18］Ortega JL, Moguel ES, Potenza C, et al. The 3' untranslated region of a soybean cytosolic glutamine synthetase（GS1）affects transcript stability and protein accumulation in transgenic alfalfa［J］. The Plant Journal, 2006, 45（5）：832-846.

［19］王曉波, 滕婉, 何雪, 童依平. 大豆谷氨酰胺合成酶基因的分類及根瘤特異表達(dá)GmGS1β2基因功能的初步分析［J］. 作物學(xué)報(bào), 2013, 39（12）：2145-2153.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of GmGS1γ Gene from Nodules of Glycine soja

In order to clarify the structures and functions of the members of the glutamine synthetase（GS）gene family，the GmGS1 gene was cloned from Glycine soja by homologous cloning. The bioinformatics analysis showed that，the ORF was 1 071 bp，and the similarity was 100% and 99% with the partial sequence of soybean GS1γ（AF363022.1）and X81700.1，respectively. The sequence had two conserved domains of plant GS，beta-Grasp GS functional area（17-97 aa），and GS catalytic functional area（103-350 aa）. Phylogenetic tree showed that GS encoded by the gene GmGS1 probably belonged to glutamine synthetase cytosolic isozyme 2. The gene was expressed in Escherichia coli DE3.0，and the molecular weight of the protein was 44 kD.

Glycine soja；glutamine synthetase（GS）；prokaryotic expression；sequence analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.015

YANG Mei-ying YUE Sheng-tian HAN Hong SUN He-mei LIU Jing-jing LU Dong-xue

（College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118）

2015-07-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201687）

楊美英，女，博士，副教授，研究方向：微生物的生化與分子生物學(xué)；E-mail：jlaumeiying@163.com