滇龍膽1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因的克隆與表達分析

張海晨李彩霞王元忠張曉東

（1. 玉溪師范學院資源環(huán)境學院，玉溪 653100；2. 云南省農業(yè)科學院藥用植物研究所，昆明 650223）

滇龍膽1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因的克隆與表達分析

張海晨1李彩霞1王元忠2張曉東1

（1. 玉溪師范學院資源環(huán)境學院，玉溪 653100；2. 云南省農業(yè)科學院藥用植物研究所，昆明 650223）

旨在克隆滇龍膽1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因GrDXS，并進行表達分析。以滇龍膽轉錄組為基礎，采用RTPCR技術從滇龍膽幼葉克隆GrDXS基因，并進行原核表達和組織特異性表達分析。滇龍膽GrDXS基因（登錄號：KJ624995）全長2 145 bp，編碼714個氨基酸；GrDXS蛋白相對分子質量76.75 kD，pI為6.93；屬于DXS家族成員，可能定位于葉綠體；主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成；具有DXS蛋白的4類保守結構域：焦磷酸硫胺素結合折疊域（IPR029061，69-425、366-555、87-268、315-407、407-558）、類轉酮酶嘧啶結合結構域（IPR005475，394-559、394-555）、轉酮酶C端/丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶結構域II（IPR009014，568-704，572-704）、轉酮酶C端結構域（IPR005476，573-696）和1個轉酮酶結合位點（IPR020826，500-516）；與長春花CrDXS蛋白親緣關系最近；GrDXS基因在大腸桿菌中表達的重組蛋白相對分子質量約為100 kD，與預期蛋白大小一致；GrDXS基因主要在葉中表達。

滇龍膽；1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶；生物信息學；表達模式

滇龍膽Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.是云南特色藥材，也是200多種中藥的主要原料［1］。近年來，隨著龍膽需求量逐年遞增，導致其野生資源遭到大肆破壞［1］。為此，2013年云南省啟動了龍膽草航天育種工程，其主要目標是培育高產、高抗、高龍膽苦苷含量、適合機械化種植和擴大種植范圍的龍膽草新品種［2］。滇龍膽主要活性成分為龍膽苦苷，要從根本上解決龍膽藥源問題和提高其龍膽苦苷含量，首先必須探明龍膽苦苷生物合成途徑及其調控機理，為通過現代生物技術手段生產龍膽苦苷奠定基礎。

龍膽苦苷屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物。在植物中，裂環(huán)環(huán)烯醚萜類骨架部分主要是通過質體2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑合成的［3］。1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，EC：4.1.3.37）是MEP途徑中的第一個催化酶，在焦磷酸硫胺素的存在下，能夠將丙酮酸與D-甘油醛3-磷酸縮合生成1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP），同時釋放二氧化碳，該反應依賴于Mg2+或Mn2+等二價陽離子［4-6］。研究表明DXS催化丙酮酸的脫羧速率能夠被甘油醛3-磷酸所加速［7］。采用LC-MS-MS方法，通過檢測DXP的產生而測定植物粗提取物中DXS酶活性的方法已被報道［8］。目前，1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因已從水稻［9］、玉米［10］、苜蓿［11］、云杉［12］、沉香［13］、熊膽草［14］、甜瓜［15］、印度人參［16］等多種植物中分離。DXS基因的表達具有組織特異性，并被生物和非生物因素誘導。在生物誘導劑（100 mg/mL酵母提取物）和非生物誘導劑（30 mmol/L Ag+）共同誘導36 h，丹參SmDXS基因在誘導后其表達量逐漸升高，在36 h時表達量達到最高［17］。在葡萄中，VvDXS基因與麝香葡萄香味相關聯，其表達受染色質狀態(tài)和不同發(fā)育時期的影響［18］。

在日本，龍膽是重要的鮮切花，其研究主要集中于花色改良方面［19，20］。在中國，龍膽是重要的大宗藥材，其研究主要集中于種子萌發(fā)［21，22］、DNA條碼［23］、育種［2］等方面，尚未對滇龍膽GrDXS基因進行研究。本研究根據滇龍膽轉錄組中GrDXS基因序列，設計一對特異性引物，通過RT-PCR技術從滇龍膽幼葉中擴增到GrDXS基因，并進行序列分析、原核表達和組織表達特異性分析，以期為滇龍膽GrDXS基因功能和龍膽苦苷生物合成途徑的解析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

滇龍膽無菌組培苗和盆栽苗均采自于玉溪師范學院分子生物學實驗室，由云南省農業(yè)科學院藥用植物研究所金航研究員鑒定為滇龍膽Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.?；蚩寺∷貌牧蠟榈猃埬憻o菌苗幼葉，基因組織特異性表達分析所用材料為盆栽3年生滇龍膽的根和葉，采樣日期為2014年5月17日。

1.2 方法

1.2.1 葉片總RNA提取及GrDXS基因ORF的克隆 按照多糖植物組織提取試劑RNAiso（TaKaRa，大連）說明書提取滇龍膽幼葉總RNA；按照逆轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）說明書合成cDNA。根據原核表達載體pGEX-4T-1多克隆酶切位點和滇龍膽轉錄組中GrDXS基因序列，設計一對特異引物 GrDXSBamHI-F：5'-GGATCCATGGCAGTTTC AGGATCTCTC-3'（下劃線為BamH I酶切位點），GrDXSXhoI-R：5'-CTCGAGTTACTTAAGCTGAAGAG CTTCTTTAGG-3'（下劃線為Xho I酶切位點，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成）。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為：PrimeSTAR Max Premix（2×）（TaKaRa，大連）25 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA模板3 μL，加ddH2O補足50 μL。PCR反應條件為：98℃變性10 s，55.4℃退火15 s，72℃延伸10 s，30循環(huán)。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、割膠，使用膠回收試劑盒（Qiagen，德國）對目的片段進行回收；使用dATP（TaKaRa，大連）和Taq DNA Polymerase（天根，北京）進行加尾，72℃反應30 min；加尾產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、割膠，使用膠回收試劑盒（Qiagen，德國）對目的片段進行回收，然后將其連接到pMD19-T載體（TaKaRa，大連）。轉化大腸桿菌DH5α（TaKaRa，大連）后進行藍白篩選，挑取12個白斑搖菌；使用堿裂解法提取質粒，經酶切檢測正確后選取3個克隆進行測序（上海生工，上海），獲得重組質粒pMD19-GrDXS。

1.2.2 GrDXS基因原核表達載體構建 對質粒pGEX-4T-1（Amersham，瑞典）和pMD19-GrDXS分別進行BamH I（TaKaRa，大連）和Xho I（TaKaRa，大連）雙酶切，回收載體片段和目的基因，按摩爾比1∶4進行過夜連接，然后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞（TaKaRa，大連），涂布于添加100 mg/L氨芐青霉素（TaKaRa，大連）+ IPTG（TaKaRa，大連）+ X-gal（TaKaRa，大連）的LB固體平板，12 h后挑取克??；搖菌后，提取質粒，經酶切檢測正確后，獲得原核表達載體pGEX-4T-1-GrDXS。

1.2.3 GrDXS基因的生物信息學分析 使用NCBI網站BLAST程序進行序列比對，應用Genetyx 6.1.8進行翻譯，使用DNAMAN 7進行多序列比對；使用Clustal X2.1進行比對，然后使用MEGA6.0軟件內置的NJ法構建系統(tǒng)進化樹，設置Bootstrap=1 000；利用在線數據庫（http://molbiol. edu.ru/eng/scripts/01_11. html）進行稀有密碼子分析。使用ChloroP服務器v1.1進行葉綠體轉運肽預測；Interpro軟件進行保守結構域預測；ProtScale軟件進行疏水性分析；PredictProtein對二級結構進行預測；Swiss-Model自動模式對三級結構進行預測；利用ExPASy中的TMHMM工具預測蛋白的跨膜螺旋區(qū)；利用在線工具WOLF PSORT預測蛋白的亞細胞定位情況。

1.2.4 GrDXS基因的原核表達 使用熱激法將重組質粒pGEX-4T-1-GrDXS轉化大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞（全式金，北京），挑取單菌落接種于3 mL含100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)12 h。然后以1∶100比例接種到無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)3 h（OD600≈0.8），在37℃、終濃度為1 mmol/L IPTG誘導下進行表達，同時以相同條件的pGEX-4T-1轉化菌作對照；分別誘導0、2、4和6 h后，收集菌液2 mL。4℃、10 000 r/min離心1 min集菌，棄上清，加入100 μL ddH2O、25 μL的5×SDSPAGE上樣緩沖液，震蕩懸菌，沸水煮5 min。4℃、13 000 r/min離心5 min。取20 μL上清上樣，進行SDS-PAGE（5%濃縮膠和12%分離膠）電泳檢測。4℃、6 000 r/min離心10 min，將誘導表達6 h的菌液50 mL進行收集，使用1×PBS對菌體進行洗滌1次。然后加入5 mL 1×PBS進行懸菌，使用JY92-IIDN型超聲細胞破碎儀（新芝，寧波）進行細胞破碎。條件為：冰浴，超聲時間30 min，工作3 s，間隔3 s，能量30%。4℃、18 000 r/min離心30 min，分離上清和沉淀。使用SDS-PAGE檢測目的蛋白。

1.2.5 GrDXS基因的實時定量分析 分別取3年生滇龍膽的根和葉，提取總RNA，使用DNase I處理除去基因組DNA。使用反轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）合成第一鏈cDNA。以轉錄組中GrGAPDH基因（GenBank登錄號KM061807）作為內參設計引物GrGAPDH-F（5'-AAGGGAGGTGCGAAGAAAGT-3'）和GrGAPDH-R（5'-AAGGAGCAAGACAGTTGGTTGT-3'），PCR反應條件為：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 31 s。根據GrDXS基因的cDNA序列設計特異性引物GrDXS-F（5'-TGATAGTGATGGCACCTTCTGA-3'）和GrDXS-R（5'-TTCTTCCCTTACCAACCTCAAA-3'）。使用SuperReal PreMix Plus試劑盒（天根，北京）進行qPCR，PCR反應條件為：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 31 s。每個反應重復3次。反應在ABI7000熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國）上進行擴增，擴增曲線、熔解曲線、標準曲線由定量PCR儀軟件自動生成。使用內參基因GrGAPDH表達校準后，計算根莖葉中GrDXS基因相對表達量。采用比較Ct值的“2-△△Ct”的方法進行定量數據的分析處理。

2 結果

2.1 滇龍膽GrDXS基因序列的克隆

以滇龍膽幼葉cDNA為模板，使用特異性引物擴增出約2 000 bp的片段（圖1）。通過TA克隆獲得重組質粒pMD19-GrDXS，酶切檢測結果表明雙酶切獲得的兩片段大小之和等于單酶切片段大小，與預期結果相符。

2.2 GrDXS基因的生物信息學分析

利用Genetyx和DNAMAN軟件對GrDXS基因cDNA序列進行分析，結果顯示GrDXS基因ORF全長2 142 bp，編碼713個氨基酸。值得注意的是，本研究中克隆到的GrDXS基因與轉錄組拼接的GrDXS核苷酸序列不完全一致，二者相似性為99.53%。將該序列上傳至GenBank數據庫，獲得登錄號KM974886。

圖1 GrDXS基因的PCR擴增

使用GenBank數據庫中的BLASTp程序對GrDXS蛋白進行比對分析，結果表明滇龍膽GrDXS與長春花CrDXS蛋白序列相似性最高（87.96%），與高良姜（Alpinia officinarum）AoDXS（AEK69519.1）蛋白相似性稍低（74.40%）。利用DNAMAN 7將GrDXS蛋白序列與從NCBI中挑選的相似性較高的部分序列進行多序列比對分析，結果（圖2）表明GrDXS蛋白與已知蛋白相似性很高。利用Mega 6.0將GrDXS蛋白序列與已發(fā)表文獻中相似性較高的序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結果（圖3）顯示，編碼滇龍膽GrDXS蛋白與長春花CrDXS2a處于同一進化枝，表明二者親緣關系較近。

使用ExPASy ProtParam tool對GrDXS蛋白進行理化性質分析，結果表明GrDXS蛋白單體相對分子質量為76.75 kD，pI為6.93；帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）為74，帶負電氨基酸殘基（Asp+Glu）為76。不穩(wěn)定指數為35.27，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪指數為90.90，總平均疏水性（GRAVY）為-0.072，為親水蛋白。GrDXS蛋白含有20種基本氨基酸，其中丙氨酸含量最高，為10.40%；其次是亮氨酸和甘氨酸，分別為9.70%和9.40%；色氨酸含量最低，為0.3%。

利用SSpro方法對GrDXS蛋白進行二級結構分析，結果表明該蛋白二級結構中α-螺旋（H）占34.45%，無規(guī)則卷曲（C）占47.06%，延伸帶（E）占18.49%。利用Swiss-Model Workspace使用自動模式預測GrDXS蛋白的三級結構，結果如圖4所示，該模型是以耐輻射球菌1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶［2o1x.1］為模板，在第69-705位氨基酸處建模，序列相似度為41.50%，其二聚體配基為Mg2+或焦磷酸硫胺素。使用InterPro在線工具對GrDXS蛋白的保守結構域進行分析，結果表明GrDXS蛋白包含4類保守結構域：焦磷酸硫胺素結合折疊域（IPR029061，69-425、366-555、87-268、315-407、407-558）、類轉酮酶嘧啶結合結構域（IPR005475，394-559、394-555）、轉酮酶C端/丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶結構域II（IPR009014，568-704，572-704）、轉酮酶C端結構域（IPR005476，573-696）和1個轉酮酶結合位點（IPR020826，500-516）。

利用SignalP 4.1服務器分析GrDXS蛋白，未發(fā)現信號肽，表明該蛋白為非分泌型蛋白。利用TMHMM工具預測GrDXS蛋白的跨膜螺旋區(qū)，結果表明GrDXS蛋白不含跨膜螺旋區(qū)域，為非膜蛋白。使用ChloroP 1.1 Server對GrDXS蛋白的葉綠體轉運肽進行預測，結果表明GrDXS蛋白含35氨基酸組成的葉綠體轉運肽，因此該蛋白定位于葉綠體。

對GrDXS基因進行稀有密碼子分析，結果表明GrDXS基因中稀有密碼子僅占0.84%，且無二聯或三聯稀有密碼子連續(xù)出現的情況，因此可選用大腸桿菌表達菌BL21或Rosetta（DE3）進行原核表達。

2.3 GrDXS基因原核表達載體的構建

使用BamH I和Xho I雙酶切質粒pGEX-4T-1-GrDXS，可獲得目的片段和載體（圖5），表明GrDXS基因已成功插入載體pGEX-4T-1中。

2.4 GrDXS基因的原核表達

將重組質粒pGEX-4T-1-GrDXS轉化大腸桿菌Rosetta（DE3）后，使用IPTG進行誘導表達。在37℃、終濃度為1 mmol/L IPTG下，分別誘導表達0、2、4和6 h后，提取細菌總蛋白進行SDS-PAGE分析。結果表明，與對照相比，pGEX-4T-1-GrDXS轉化菌經IPTG誘導后，在相對分子質量約100 kD（含GST蛋白26 kD）處有1條蛋白條帶，并且隨誘導時間增加其蛋白含量逐漸增加，表明重組質粒pGEX-4T-1-GrDXS在大腸桿菌Rosetta（DE3）中成功誘導表達了GrDXS蛋白。當溫度為37℃、誘導時間為6 h時，蛋白表達量最大（圖6）。為檢測GrDXS融合蛋白的存在形式，對誘導表達6 h的菌體進行超聲破碎，然后使用SDS-PAGE檢測，結果（圖7）表明GrDXS蛋白全部以包涵體形式存在。

圖2 GrDXS蛋白與其它植物DXS蛋白的多序列比對結果

圖3 GrDXS蛋白與植物中其它DXS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.5 GrDXS基因的組織表達分析

取3年生滇龍膽的根和葉，通過qRT-PCR分析GrDXS基因在不同組織中的表達情況。結果（圖8）表明，GrDXS基因在葉中表達量遠高于其在根中表達量。

3 討論

代謝途徑中終產物的量取決于該途徑的流量，而流量本身又取決于轉換相應中間產物的每個酶反應步驟的速率［8］。鑒定對代謝通量起重要作用的酶，將有助于對萜類化合物生物合成調控機制的闡明［8］。滇龍膽的主要藥效成分龍膽苦苷屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜類，主要通過MEP途徑合成。在植物中，1-脫氧木酮糖5-磷酸合酶被認為是MEP途徑的一個限速酶［14，24］。因此，滇龍膽中GrDXS基因的表達情況直接或間接影響龍膽苦苷的生物合成。本研究對滇龍膽GrDXS基因進行克隆和生物信息學分析，結果表明所克隆的GrDXS基因ORF全長2 142 bp，編碼713個氨基酸，pI為6.93，這分別與印度人參WSDXS蛋白和牛巴貝斯蟲BbDXS蛋白類似［16，25］；GrDXS蛋白具有DXS蛋白中4類保守結構域：焦磷酸硫胺素結合折疊域、類轉酮酶嘧啶結合結構域、轉酮酶C端/丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶結構域II、轉酮酶C端結構域，與長春花CrDXS蛋白序列相似性高達87.96%，因此所克隆基因為GrDXS基因。

圖4 GrDXS蛋白二聚體的三維結構預測

圖5 質粒pGEX-4T-1-GrDXS酶切檢測

圖6 37℃下誘導時間對GrDXS蛋白表達量的影響

圖7 GrDXS融合蛋白存在形式的檢測

圖8 GrDXS基因在根和葉中的相對表達

在植物中，DXS基因是以家族形式存在的［26］。根據系統(tǒng)發(fā)育分析、生化特征和基因表達特征，DXS蛋白可分為3類：第I類是在綠色組織中組成型表達，能夠為持家代謝物或光合作用代謝物如類胡蘿卜素和葉綠素的合成提供前體；第II類是在特定組織中表達，如與菌根共生累積前胡蘿卜素的根或小蠹或真菌感染針葉松樹脂道表皮細胞；第III類是最近幾年才提出的，其功能還未被最終確定［15］。在本研究中，系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明GrDXS蛋白屬于第II類DXS蛋白，由于其又包含35個氨基酸的葉綠體轉運肽，推測其在葉綠體中參與MEP途徑。

DXS基因的表達具有組織和時空特異性，并與萜類的生物合成相關聯。在熊膽草中，CbDXS基因的表達水平與其藥效成分二萜苦蒿素的濃度高度相關［14］，而在擬南芥中AtDXS能夠通過MEP途徑控制二氧化碳的代謝流量［6］。在煙草中，過表達SlDXS和香葉基焦磷酸合成酶基因NtGPPS2導致二萜產量加倍［27］。在滇龍膽中，龍膽苦苷是在植物綠色組織（葉和莖）合成，然后通過莖轉運到根中進行儲藏的［28］。對滇龍膽GrDXS基因組織表達特異性檢測結果表明，GrDXS基因在葉中的表達量遠遠高于根，這與上述報道相一致。

本研究為滇龍膽GrDXS基因功能的解析奠定基礎。下一步將對GrDXS蛋白進行純化和多克隆抗體制備、通過過表達或互補實驗研究GrDXS基因的功能，為龍膽苦苷生物合成途徑的闡明奠定基礎。

4 結論

本研究成功克隆滇龍膽GrDXS基因，并可表達出gst-DXS蛋白，且該基因在葉中表達量遠遠高于根中。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Analysis of Gene Encoding 1-Deoxy-D-xylulose 5-Phosphate Synthase in Gentiana rigescens

ZHANG Hai-chen1LI Cai-xia1WANG Yuan-zhong2ZHANG Xiao-dong1
（1. College of Resources and Environment，Yuxi Normal University，Yuxi 653100；2. Institute of Medicinal Plants，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650223）

The aims of this study are to clone the gene GrDXS encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase from Gentiana rigescens，and to analyze its expression. Based on the transcriptome of G. rigescens，a GrDXS gene was cloned from young leaves of G. rigescens by RT-PCR technology，and its prokaryotic and tissue-specific expression were also performed. The GrDXS gene（GenBank accession number：KJ624995）had a length of 2 145 bp coding for 714 amino acids，and the relative molecular weight of GrDXS protein was 76.75 kD with its pI of 6.93. GrDXS protein belonged to the member of DXS superfamily，and may localize in chloroplast，GrDXS protein composed of mainly random coil（47.06%）and α-helix（34.45%）. Four kinds of conserved domains: Thiamin diphosphate-binding fold（IPR029061，69-425，366-555，87-268，315-407，407-558），Transketolase-like，pyrimidine-binding domain（IPR005475，394-559，394-555），Transketolase C-terminal/Pyruvate-ferredoxin oxidoreductase，domain II（IPR009014，568-704，572-704），and Transketolase binding site（IPR020826，500-516），were all existing in GrDXS protein. GrDXS protein was the closest with CrDXS in Catharanthus roseus. The recombinant protein of GrDXS gene in Escherichia coli was approximately 100.00 kD（containing GST tag protein 26 kD），which was consistent with the anticipated size. GrDXS gene was primarily expressed in leaf.

Gentiana rigescens；1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase；bioinformatics；expression pattern

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.017

2015-05-16

云南省大學生創(chuàng)新訓練項目（201411390001）

張海晨，女，研究方向：植物分子生物學；E-mail：1285290757@qq.com

張曉東，男，博士，副教授，研究方向：植物代謝基因工程；E-mail：zxd95@126.com