樊星 王淑婷 李春艷

（東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030）

一株高效鐵錳氧化細菌P1的分離鑒定及氧化條件優(yōu)化

樊星 王淑婷 李春艷

（東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030）

利用富集培養(yǎng)技術(shù)從富含鐵錳的地下水井淤泥中分離得到1株能夠氧化鐵錳的細菌，命名為P1。經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，將菌株P(guān)1鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。利用單因素實驗探討菌株P(guān)1的生長及氧化特性；采用響應(yīng)面分析方法考察接種量、溫度、pH值3個因素對菌株P(guān)1氧化特性的影響，進一步優(yōu)化菌株的氧化條件。結(jié)果表明，菌株P(guān)1的最佳氧化條件：溫度28.54℃，pH7.23，接種量4.35%。在此條件下，菌株P(guān)1在錳含量為200 mg/L、鐵含量為800 mg/L的選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d后，錳氧化率達 93%以上，鐵氧化率達100%。

鐵錳氧化；Bacillus cereus；分離鑒定；氧化條件；響應(yīng)面分析法

鐵、錳是地殼的主要構(gòu)成成分，廣泛分布于自然界中。地下水在徑流地下的過程中，由于化學作用、物理作用及生物作用溶解了不同濃度的鐵、錳離子以及其他物質(zhì)，地下水的優(yōu)良品質(zhì)受到了破壞［1］。我國北方地區(qū)地下水鐵、錳超標相對于南方較嚴重，鐵、錳超標的地區(qū)主要分布在松花江流域［2］。地下水中鐵、錳含量過高會帶來諸多危害，主要包括以下幾個方面：易使衣物染色，水有鐵腥異味，F(xiàn)e2O3等鐵質(zhì)沉淀物會滋長鐵細菌，阻塞管道，嚴重時會出現(xiàn)紅水現(xiàn)象；作為造紙、紡織、印染、化工、食品等生產(chǎn)用水會降低產(chǎn)品質(zhì)量，腐蝕生產(chǎn)設(shè)備及用具；長期飲用含鐵、錳量過高的水還會嚴重影響身體健康，造成胰腺、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病，甚至導致人體慢性中毒［3-6］。因此，含有過量鐵、錳的地下水，需要處理后才能滿足工業(yè)生產(chǎn)和人民生活的要求。

地下水除鐵、錳技術(shù)經(jīng)歷了從自然氧化法、接觸氧化法向生物氧化法的過渡階段。由于自然氧化法和接觸氧化法在實施過程中存在許多問題，如操作流程復雜、處理成本高、運行難度大，出水水質(zhì)不穩(wěn)定和易造成二次污染等弊端［7］，而生物氧化法由于具有效果好，運行效果穩(wěn)定，無有毒副產(chǎn)物之患，投資少等優(yōu)點［8］更為人們所接受。目前，國內(nèi)對于生物氧化法的研究主要集中在鐵氧化菌、錳氧化菌的篩選上，而對于鐵錳氧化菌的篩選研究較少，且篩選出的菌株對于錳離子的去除效果不理想［9，10］。因此，有針對性地篩選具有高效鐵錳氧化能力的菌株，將其應(yīng)用于地下水處理過程具有重要意義。

本研究通過富集培養(yǎng)，采用特異性培養(yǎng)基從地下水井淤泥中篩選出具有高效鐵錳氧化能力的細菌，結(jié)合形態(tài)學、生理生化特性和16S rDNA序列分析等對其進行鑒定，利用單因素實驗探討菌株的生長及氧化特性，采用響應(yīng)面分析法對該菌株的氧化條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

選用黑龍江省紅旗農(nóng)場富含高鐵高錳污染物的地下水井淤泥作為微生物富集培養(yǎng)來源。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 10.0 g，加去離子水至1 L，pH調(diào)至7.0。

PYCM改良培養(yǎng)基［11］：蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.3 g，酵母浸膏0.2 g，MnSO4·H2O 0.2 g，K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaNO30.2 g，CaCl20.1 g，（NH4）2CO30.1 g，檸檬酸鐵銨0.8 g，去離子水1 000 mL，pH6.8-7.2，滅菌20 min。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂，濕熱滅菌后使用。

1.2 方法

1.2.1 高效鐵錳氧化菌的富集與分離 無菌水稀釋泥樣，攪拌10 min，取0.2 mL稀釋液加入到100 mL的LB培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)24 h；取上述培養(yǎng)液5 mL加入到100 mL的鐵離子濃度為80 mg/L，錳離子濃度為20 mg/L的PYCM改良培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min 的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)；然后每隔1周以10%（體積分數(shù)）的接種量接入到新鮮的PYCM改良培養(yǎng)液中，并逐漸提高鐵錳離子濃度，至培養(yǎng)液中鐵離子濃度達到800 mg/L，錳離子濃度達到200 mg/L，如此馴化約2個月。

取0.1 mL混合樣涂布于PYCM改良培養(yǎng)基固體平板上，28℃培養(yǎng)至有明顯單菌落。針對生長良好的單菌落，于鐵離子濃度為800 mg/L，錳離子濃度為200 mg/L 的PYCM改良培養(yǎng)基固體平板上進一步劃線培養(yǎng)，分離純化3-4次，獲得純化后的多株鐵錳氧化菌株。將菌株回接于PYCM改良培養(yǎng)液中，驗證是否對鐵、錳離子有氧化能力［12］。通過測定培養(yǎng)液中鐵錳離子含量、比較所得功能菌株的氧化能力，篩選出1株高效鐵錳氧化菌，命名為P1，并將其接種于PYCM改良斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后，待長出明顯菌落后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

鐵/錳氧化率的計算公式如下：

式中，氧化率總鐵/總錳：培養(yǎng)基接種培養(yǎng)后Fe2+/ Mn2+的總氧化率；氧化率對照組：未接種菌株培養(yǎng)基中Fe2+/ Mn2+氧化率；d（Fe2+/ Mn2+）初始：培養(yǎng)基中初始的Fe2+/ Mn2+質(zhì)量濃度（mg/L）；d（Fe2+/ Mn2+）剩余：接種培養(yǎng)基中剩余Fe2+/ Mn2+質(zhì)量濃度（mg/L）；d（Fe2+/ Mn2+）對照剩余：對照組培養(yǎng)基中剩余Fe2+/ Mn2+質(zhì)量濃度（mg/L）；氧化率鐵/錳：培養(yǎng)基中菌株生物氧化作用的Fe2+/ Mn2+氧化率。

1.2.2 高效鐵錳氧化菌的鑒定［13］

1.2.2.1 高效鐵錳氧化菌的形態(tài)觀察 將高效鐵錳氧化菌P1采用平板涂布法接種于PYCM改良固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。用光學顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對其進行生理生化鑒定［14］。

1.2.2.2 高效鐵錳氧化菌的16S rDNA序列測定 提取細菌總DNA［15］， 采用細菌的16S rDNA通用引物［12］，上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物：5'-GGTTACCTTCTTACGACTT-3'，引物由大連寶生物有限公司合成。以提取的總DNA作為模板，對該菌株的16S rDNA進行PCR擴增。反應(yīng)體 系：dNTPs 4 μL（2.5 mmol/L）、10×buffer 5 μL、上游引物及下游引物各2 μL（50 μmol/L）、Ex Taq酶0.5 μL、模板DNA 2 μL，加去離子水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預變性5 min；94℃變性50 s，60℃退火90 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min［12］。PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠中電泳，并于紫外光下觀察，然后將純化后的PCR擴增產(chǎn)物送上海生工測序［16］。測序結(jié)果用BLAST軟件在GenBank中進行同源性比較，采用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［17］。

1.2.3 高效鐵錳氧化菌株生長及氧化條件的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實驗 分別以20℃、24℃、28℃、32℃和36℃作為溫度實驗組；以5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0作為pH實驗組；以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%和7.0%作為菌體接種量實驗組；以12、24、36、48、60、72和84 h作為培養(yǎng)時間實驗組。以上各實驗組的PYCM改良培養(yǎng)液均為50 mL，接種用菌懸液OD600值均調(diào)至1.0，恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，以不加菌作為陰性對照，以蒸餾水作為空白對照，在培養(yǎng)第3天測定鐵錳氧化率及生長量OD600，分別采用過硫酸銨分光光度法和二氮雜菲分光光度法測定鐵、錳濃度［18］。每個處理設(shè)3個平行重復。

1.2.3.2 鐵錳氧化菌響應(yīng)面分析實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以溫度（A）、pH（B）、接種量（C）為自變量，以培養(yǎng)液中鐵離子的氧化率（Y1）和錳離子的氧化率（Y2）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken design（BBD）模型，設(shè)計三因素三水平的二次回歸方程擬合自變量和鐵錳氧化率之間的函數(shù)關(guān)系，優(yōu)化鐵錳氧化的最佳環(huán)境條件。其中實驗設(shè)計因素水平見表1。二次回歸方程用以擬合自變量和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系［19］，公式如下：

式中，Y：預期響應(yīng)值；A：常數(shù)；Aj：單因素直線系數(shù)；Ajj：單因素平方系數(shù)；Aij：兩個因素的交互系數(shù)。

表1 菌株P(guān)1的響應(yīng)面實驗因子及水平列表

1.2.4 最佳培養(yǎng)及氧化條件驗證實驗 將菌株P(guān)1接種于PYCM改良培養(yǎng)液中，在最佳條件下培養(yǎng)3 d后，每12 h取樣檢測菌株的生長量OD600，同時，測定培養(yǎng)液中鐵錳離子的剩余濃度，計算氧化率，設(shè)置3組平行驗證實驗。

2 結(jié)果

2.1 高效鐵錳氧化菌的分離純化

經(jīng)分離與純化獲得1株高效鐵錳氧化細菌，命名為P1。菌株P(guān)1菌落培養(yǎng)特征、革蘭氏染色照片和透射電鏡照片如圖1所示。菌株P(guān)1菌落和菌體形態(tài)特征分別見表2，生理生化指標見表3。

圖1 菌株P(guān)1菌落及菌體形態(tài)

2.2 基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株P(guān)1序列已在GenBank中注冊，登錄號為KP241859。菌株P(guān)1與數(shù)據(jù)庫中8個同源性較高的細菌模式株進行比較，菌株P(guān)1的16S rDNA序列與蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus有較高的序列同源性，相似性高達99.0%。其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系見圖2。目前，細菌分類學家的共識是當某兩個細菌的16S rDNA的相似性大于95%時，可將其歸為同一屬。從系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，菌株P(guān)1屬于Bacillus cereus。

表2 菌株P(guān)1形態(tài)特征

表3 菌株P(guān)1生理生化特征

圖2 菌株P(guān)1的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 單因素實驗結(jié)果

不同因素對菌株P(guān)1生長量及鐵、錳氧化能力的影響情況，結(jié)果（圖3）顯示，當溫度為28℃時，菌株P(guān)1生長量和鐵、錳氧化率均達到最高點，生長量為1.812，鐵、錳氧化率最大值分別為79.8%和 70.7%（圖3-A）。菌株P(guān)1生長量及鐵、錳氧化率均隨pH增加先增大后減小，當pH7.0時，菌株鐵、錳氧化率達最大值，分別為79.7%和68.5%。當pH為6.5-7.5時，菌株P(guān)1生長及氧化能力最佳（圖3-B）。接種量為4%時，菌株P(guān)1生長量和鐵、錳氧化率均達到最大值，分別為1.801、81.7%和70.5%，可知4%為最佳接種量（圖3-C）。菌株P(guān)1生長量及鐵、錳氧化率隨培養(yǎng)時間延長呈現(xiàn)出先升高后下降趨勢，當培養(yǎng)時間為72 h，菌株P(guān)1鐵錳氧化率達到最大值，分別84.9%和68.2%（圖3-D）。綜上所述，影響菌株P(guān)1生長量和鐵、錳氧化能力的最適條件為溫度28℃、pH7.0、接種量4%、培養(yǎng)時間72 h。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

菌株P(guān)1的響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果如表4所示，每個響應(yīng)值實驗總共17組，其中包括5組零點實驗，以估計實驗誤差。利用Design-Expert 8.0.6軟件，對BBD模型實驗數(shù)據(jù)進行多項回歸分析后，得到二次擬合模型為：

式中，Y1為菌株P(guān)1對鐵的氧化率，Y2為菌株P(guān)1對錳的氧化率；A1、B1、C1和A2、B2、C2分別為溫度、pH、接種量的編碼值。表5是利用Design-Expert 8.0.6軟件分析得出的菌株P(guān)1鐵、錳氧化率響應(yīng)分析實驗的回歸分析結(jié)果。

由菌株P(guān)1的回歸分析結(jié)果可知，菌株鐵氧化率、錳氧化率的失擬P值均>0.05，而鐵氧化率、錳氧化率的模型P值均<0.000 1，表明方程與實際情況擬合良好。由模型預測擬合度Pred R2和模型擬合系數(shù)R2可知，鐵、錳氧化率的實驗值與預測值之間具有良好擬合度；其校正后的擬合系數(shù)表明方程模型具有很高的可信度。信噪比大于4時表明模型合理，模型的信噪比Adeq Precisior1=38.930、Adeq Precisior2=32.568， 表 明 模型合理［20］。由表5可知，在菌株P(guān)1的響應(yīng)分析實驗中溫度、pH的P值均<0.000 1，說明它們對菌株P(guān)1鐵、錳氧化率具有極顯著影響，同時，在以鐵氧化率為響應(yīng)值的響應(yīng)分析實驗中，接種量的P值為0.002 2，表明溫度和pH對菌株鐵氧化率的影響較接種量大，從溫度（F=171.14）與pH（F=200.06）的F值可以看出pH對鐵氧化率的影響較溫度更為顯著。而在以錳氧化率為響應(yīng)值的響應(yīng)分析實驗中，接種量P值為0.501 7，表明接種量對菌株錳氧化率沒有顯著影響，從溫度與pH的F值可知F溫度

圖3 各因素對菌株P(guān)1生長量及氧化能力的影響

表4 菌株P(guān)1響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

表5 菌株P(guān)1響應(yīng)分析實驗方差分析結(jié)果

由上述結(jié)果可知，各因素對菌株鐵、錳氧化率的影響作用由大到小依次為：pH>溫度>接種量。

圖4為不同交互組合對菌株P(guān)1鐵錳氧化能力影響的響應(yīng)曲面圖。結(jié)合圖中等高線圖和響應(yīng)曲面圖能夠很好地分析交互組合對響應(yīng)值的影響情況。如圖所示，當各因素固定在零水平時，較高氧化率集中在曲面的中心區(qū)域，且在此區(qū)域內(nèi)均存在菌株氧化率的極值點，經(jīng)軟件分析可以得到曲面的最高點，即3個因子的最優(yōu)實驗點，所得菌株P(guān)1氧化鐵離子的最優(yōu)實驗條件為：溫度28.3℃，pH7.18，接種量4.27%；氧化錳離子的最優(yōu)實驗條件為：溫度28.9℃，pH7.27，接種量4.46 %。

經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析可得菌株P(guān)1的鐵錳氧化率最優(yōu)條件為：接種量4.35%，pH7.23，溫度28.54℃。

圖4 不同因素對菌株P(guān)1氧化率產(chǎn)生交互影響的響應(yīng)曲面圖

2.5 最佳條件驗證結(jié)果

在最佳條件下進行3組平行驗證實驗，所得菌株P(guān)1的生長量及鐵錳氧化效果（圖5）顯示，通過對高效鐵錳氧化株菌生長及氧化環(huán)境的優(yōu)化，使得菌株在3 d內(nèi)對鐵的氧化率達到100%，而對錳的氧化率達到93%以上。

3 討論

隨著地下水中高鐵錳污染情況的日益突出，近年來關(guān)于微生物應(yīng)用于處理富含鐵錳地下水的研究逐漸引起重視。國內(nèi)對于鐵錳生物氧化法的研究主要集中在鐵氧化菌、錳氧化菌的篩選、鐵錳氧化去除條件以及應(yīng)用方面的研究上［22］，已篩選的具有鐵氧化能力和錳氧化能力的細菌主要包括弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）［21］，節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）［23］和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）［24］等。目前，對于同時具備鐵氧化能力和錳氧化能力的鐵錳氧化菌株的篩選、生理生化研究以及氧化條件優(yōu)化等方面研究的較少［9-13］。而已篩選的具有鐵錳氧化能力的細菌主要有假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）［11］和金黃桿菌屬（Chryseobacterium sp.）［25］，其鐵氧化率均可達到90%以上，但錳氧化率均不理想，且氧化過程持續(xù)時間較長，一般為6 d左右。因此，篩選出在富含鐵錳地下水條件下，具有高效鐵錳氧化能力的細菌對高鐵錳地下水處理至關(guān)重要。

本實驗采用特異性的選擇培養(yǎng)基從富含鐵錳的地下水井淤泥中分離篩選具有鐵錳氧化能力的菌株，同時，對菌株的鐵、錳氧化條件進行優(yōu)化。常用的優(yōu)化方法主要有正交實驗法和響應(yīng)曲面法兩種。正交實驗法有一定局限性，它多采用線性模型，只能對一個個孤立的實驗點進行分析，無法精確找出整個區(qū)域內(nèi)因素最佳組合和最大響應(yīng)值［26］。而響應(yīng)曲面法則采用更為合理的實驗設(shè)計方案，并同時考慮實驗隨機誤差的影響，以回歸分析方法作為函數(shù)估算工具，將多因素實驗的回歸因素和實驗結(jié)果用簡單的二次多項式模型來擬合，計算相對簡便，它能夠連續(xù)對實驗各個水平進行分析，預測模型為一個曲面，并且能夠在整個區(qū)域內(nèi)獲得最佳因素組合和最優(yōu)響應(yīng)值［27］。因此本實驗采用響應(yīng)面分析方法對菌株的鐵、錳氧化條件進行優(yōu)化。研究結(jié)果表明，各因素對菌株鐵、錳氧化率的影響作用由大到小依次為：pH>溫度>接種量。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后鐵、錳氧化率均比優(yōu)化前明顯提高。

在鐵錳氧化反應(yīng)體系中，主要存在兩種氧化方式，分別為化學氧化和生物氧化［23］。在本研究過程中發(fā)現(xiàn)，兩種氧化作用中生物氧化占主導地位。其中化學氧化隨著pH值升高氧化率表現(xiàn)逐漸上升趨勢。由于pH值為生物氧化中菌株氧化的主要影響因素，隨著pH值的逐漸升高，生物氧化率表現(xiàn)為先升高后下降的情況，在菌株最適pH7.23時，生物氧化率最高。因此隨著pH值的逐步升高，總氧化率呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。

另外，后續(xù)研究還將進一步考查多株高效鐵錳氧化菌的復配并研究復配菌劑對富含鐵錳地下水的處理效果，為富含鐵錳地下水處理新方法的開發(fā)提供技術(shù)支持。

圖5 菌株P(guān)1的生長量及鐵錳氧化效果

4 結(jié)論

本實驗從富含鐵錳的地下水井淤泥中分離獲得1株能夠氧化鐵錳的細菌Bacillus cereus P1，在培養(yǎng)溫度28℃，pH7，接種量4%的條件下，于錳含量為200 mg/L、鐵含量為800 mg/L的選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d后，鐵、錳氧化率分別為82%和73%。

采用響應(yīng)面分析方法對菌株P(guān)1鐵、錳氧化條件進行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為：溫度28.54℃，pH7.23，接種量4.35%，鐵、錳氧化率最高分別可達100%和93.7%，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后鐵、錳氧化率比優(yōu)化前分別提高18%和19.3%。

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（責任編輯 李楠）

The Isolation and Identification of an Efficient Fe/Mn-oxidizing Bacterial Strain P1，and the Optimization of Its Oxidizing Conditions

FAN Xing WANG Shu-ting LI Chun-yan
（College of Resource and Environment，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

By enrichment culture，a Fe/Mn-oxidizing bacterial strain P1 was isolated from the sludge samples of groundwater well that was rich in Fe/Mn. According to morphologic and physiological-biochemical characteristics as well as 16S rDNA sequence analysis，strain P1 was identified as Bacillus cereus. Concurrently，single factor test was used to study the growth of strain P1 and its oxidation characteristics；and the response surface methodology（RSM）was employed to explore the effects of inoculation size，temperature and pH on the oxidation characteristics of strain P1 and further optimize the oxidation conditions. The results showed that the optimal oxidation conditions were temperature 28.54℃，pH 7.23，and inoculation size 4.35 %. At the optimal conditions，the removal ratios of Mn and Fe were 93 % and 100 % respectively in the selective medium containing 200 mg/L Fe and 800 mg/L Mn after strain P1 was cultured for 3 d.

Fe/Mn-oxidizing；Bacillus cereus；isolation and identification；oxidation conditions；response surface methodology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.023

2015-09-29

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAJ12B01），東北農(nóng)業(yè)大學大學生SIPT計劃創(chuàng)新訓練項目（201510224257）

樊星，男，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：good150030@sina.com

李春艷，女，博士，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：chunyanli@neau.edu.cn