馬艷玲劉富來張敏孫宇輝洪葵

（1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品與園藝學(xué)院，佛山 528231；2. 武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430071）

阿扎霉素F產(chǎn)生菌鏈霉菌211726基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立

馬艷玲1劉富來1張敏1孫宇輝2洪葵2

（1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品與園藝學(xué)院，佛山 528231；2. 武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430071）

旨在建立阿扎霉素F產(chǎn)生菌鏈霉菌211726的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，以便基因敲除和外源基因表達(dá)等遺傳操作。以整合型質(zhì)粒pSET152和pIB139為出發(fā)質(zhì)粒，通過接合轉(zhuǎn)移構(gòu)建了阿扎霉素F產(chǎn)生菌鏈霉菌211726的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。結(jié)果顯示25 μg/mL阿泊拉霉素可有效篩選接合子。經(jīng)PCR驗(yàn)證，質(zhì)粒成功整合到菌株鏈霉菌211726基因組中，接合子經(jīng)多次傳代后，導(dǎo)入的質(zhì)粒 pSET152和pIB139仍穩(wěn)定整合于接合子基因組上。

阿扎霉素F；鏈霉菌211726；接合轉(zhuǎn)移；遺傳穩(wěn)定性

鏈霉菌（Streptomyces）在分類學(xué)上屬于原核生物界、放線菌目、鏈霉菌科，是一類具有分枝絲狀體的好氧革蘭氏陽性細(xì)菌［1］，是土壤中主要的微生物類群之一。鏈霉菌基因組平均大小為8 000 kb，約為大腸桿菌基因組的兩倍［2］。同其它生物相比，其基因組最大特征之一就是其DNA具有極高的G+C mol%，可高達(dá)69%-78%，是迄今為止已知的G+C mol%含量最高的生物類群之一［3］。鏈霉菌是工業(yè)微生物中最具有商用價(jià)值的類群之一。人們已經(jīng)了解到自然界中有近70%的抗生素是由鏈霉菌及其近緣放線菌產(chǎn)生的。自1928年Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)第一個(gè)抗生素——青霉素以來，數(shù)以萬計(jì)的抗生素正源源不斷地被人們發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)造出來并造福于人類［4-7］。

阿扎霉素F最早是由Arai［8］于1959年發(fā)現(xiàn)并從吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus var.中分離得到的。1995年，Krystofova［9］研究組對該抗生素的鈣離子通道作用進(jìn)行了初步的研究。

2010年，研究人員在海南省的沿海紅樹林根系土壤中分離純化得到Streptomyces sp. 211726。經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定，發(fā)現(xiàn)它可以同時(shí)產(chǎn)生13種結(jié)構(gòu)略有差異的系列阿扎霉素，區(qū)別僅僅在于阿扎霉素C-23位和C-25上連接的基團(tuán)不同［10-13］，并對所發(fā)現(xiàn)的這13種化合物命名為阿扎霉素S4-S16，其中S13、S15和S16分別與國際上已報(bào)道的阿扎霉素F3a、F4a和F5a結(jié)構(gòu)一致［14］。生物學(xué)活性檢測表明，在這一系列化合物中以阿扎霉素F3a為代表的多種化合物都具有明顯的抗尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）活性［10-13］，表明該類抗生素在抗香蕉枯萎病病原菌具有良好防治作用。這些化合物還對白色念珠菌表現(xiàn)出明顯的拮抗作用，其抗白色念珠菌（Candida albicans）的有效性與氟康唑（Fluconazole）和兩性霉素B相當(dāng)，就其毒性而言，阿扎霉素F系列化合物的毒性較氟康唑大，但是小于兩性霉素B［15］。此外，毒性實(shí)驗(yàn)還表明在Streptomyces sp. 211726所產(chǎn)生的阿扎霉素F系列化合物中除阿扎霉素F5a外其余12種化合物均對人類結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒作用，預(yù)示著該系列化合物在人類腫瘤疾病治療方面的潛在應(yīng)用［13］。由于致病真菌耐藥性的日益嚴(yán)重和結(jié)構(gòu)修飾研究的日益深入，因此開展以提高有效性、降低毒性為目的的結(jié)構(gòu)改造研究越來越得到人們的廣泛關(guān)注。但是目前關(guān)于阿扎霉素F的分子水平上的結(jié)構(gòu)改造研究還尚未報(bào)道，這可能與其限制性修飾作用強(qiáng)，遺傳操作困難有關(guān)。因此，有必要建立起阿扎霉素F產(chǎn)生菌鏈霉菌21172的接合轉(zhuǎn)移體系，以推動(dòng)其分子生物學(xué)研究。

本研究擬建立阿扎霉素F產(chǎn)生菌鏈霉菌211726的基因轉(zhuǎn)移體系，探討通過接合轉(zhuǎn)移向鏈霉菌211726導(dǎo)入外源DNA片段的可能性，旨在為該菌的生物合成基因改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 阿扎霉素F產(chǎn)生菌鏈霉菌211726是洪葵教授贈(zèng)與，基因克隆受體E.coli DH10B、接合轉(zhuǎn)移供體菌E.coli ET12567（pUZ8002）、整合型質(zhì)粒pSET152和pIB139（均攜帶阿泊拉霉素抗性基因aac（3）IV，接合轉(zhuǎn)移位點(diǎn)oriT）均為筆者實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 硫鏈絲菌素和阿泊拉霉素購自美國Sigma公司；氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、硫鏈絲菌素、Lambda/Hind III、限制性內(nèi)切酶、DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；其他常用試劑均購于上海國藥集團(tuán)。

1.1.3 培養(yǎng)基和抗生素 鏈霉菌211726的平板培養(yǎng)基為 SFMS，培養(yǎng)細(xì)菌的為LB培養(yǎng)基、孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基為2×YT、接合轉(zhuǎn)移使用的是SFMS培養(yǎng)基。

LB中抗生素終濃度為：阿泊拉霉素25 μg/mL，氯霉素25 μg/mL，卡那霉素25 μg/mL，氨芐青霉素100 μg/mL；接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中抗生素終濃度為阿泊拉霉素25 μg/mL，萘啶酮酸25 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn) 將已滅菌的SFMS培養(yǎng)基融化，溫度降至45℃，加入適當(dāng)質(zhì)量濃度的抗生素（卡那霉素 0-100 μg/mL；氯霉素 0-100 μg/mL；阿泊拉霉素 0-100 μg/mL；硫鏈絲菌素 0-100 μg/ mL），將鏈霉菌211726菌株的孢子懸液涂布平板，28℃培養(yǎng)5 d，根據(jù)鏈霉菌211726菌株生長狀態(tài)評定鏈霉菌211726菌株對抗生素的敏感性。

1.2.2 質(zhì)粒DNA的跨屬接合轉(zhuǎn)移 將整合型質(zhì)粒pSET152和pIB139通過CaCl2法導(dǎo)入接合轉(zhuǎn)移供體菌E.coli ET12567（pUZ8002）中，借助于pUZ8002上tra基因，上述兩種質(zhì)粒以接合轉(zhuǎn)移方式從大腸桿菌導(dǎo)入到鏈霉菌211726細(xì)胞中，并進(jìn)行整合。接合轉(zhuǎn)移方法主要依據(jù)文獻(xiàn)［16］進(jìn)行改進(jìn)。

1.2.3 接合轉(zhuǎn)移子的驗(yàn)證 以整合型質(zhì)粒pSET152和pIB139上的阿泊拉霉素抗性基因aac（3）IV為模板，設(shè)計(jì)引物CP1和CP2以驗(yàn)證陽性接合轉(zhuǎn)移子。CP1：5'-TTTATCACCACCGACTATTTGC-3'；CP2：5'-TCATCTCGTTCTCCGCTCA-3'。按照文獻(xiàn)［9］方法提取鏈霉菌211726基因組DNA并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。PCR條件反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 1 min；98℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min。

1.2.4 質(zhì)粒pSET152和pIB139在鏈霉菌211726接合轉(zhuǎn)移子中的穩(wěn)定性 將接合子接種于不含抗生素的SFMS平板上，待其孢子成熟（約15 d）后，再次接種于不含抗生素的SFMS平板上，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次后進(jìn)行分離純化，隨機(jī)挑選單菌落，轉(zhuǎn)接到含有25 μg/mL阿泊拉霉素的SFMS平板上，5 d后根據(jù)單菌落能否生長來確定質(zhì)粒pSET152和pIB139在接合子中的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 鏈霉菌211726對不同抗生素抗性水平的檢測

為確定抗生素抗性基因能否用于鏈霉菌211726菌株進(jìn)行遺傳操作的選擇標(biāo)記，檢測了鏈霉菌211 726菌株對幾種抗生素（阿泊拉霉素、氯霉素、卡那霉素、硫鏈絲菌素等）的抗性水平。結(jié)果（表1）顯示，鏈霉菌211726菌株在含有12.5 μg /mL卡那霉素和阿泊拉霉素的培養(yǎng)基上不能生長，表明鏈霉菌211726菌株對卡那霉素和阿泊拉霉素非常敏感；鏈霉菌211726菌株在含有25 μg /mL氯霉素的培養(yǎng)基上不能生長，表明鏈霉菌211726菌株對氯霉素比較敏感；鏈霉菌211726菌株在含有硫鏈絲菌素100 μg/mL的培養(yǎng)基上都能生長，說明鏈霉菌211726對硫鏈絲菌素不敏感。鑒于本研究中使用的接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒攜帶有阿泊拉霉素抗性基因aac（3）IV，因此以25 μg /mL阿泊拉霉素篩選接合轉(zhuǎn)移子。

表1 鏈霉菌211726在4種不同濃度抗生素平板上的生長情況

2.2 鏈霉菌211726與大腸桿菌之間兩親接合轉(zhuǎn)移

通過兩親接合轉(zhuǎn)移法分別將質(zhì)粒pSET152和pIB139從供體菌E.coli ET12567（pUZ8002）導(dǎo)入到鏈霉菌211726的新鮮菌絲體和孢子中，結(jié)果表明，在鏈霉菌211726菌株萌發(fā)孢子作為受體菌與含有質(zhì)粒pSET152和pIB139的大腸桿菌E.coli ET12567（pUZ8002）菌株進(jìn)行兩親接合轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)中，能夠獲得阿泊拉霉素的抗性菌落；而在鏈霉菌211726菌株新鮮菌絲體作為受體菌與含有質(zhì)粒pSET152和pIB139的大腸桿菌E.coli ET12567（pUZ8002）菌株進(jìn)行的兩親接合轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)中，沒有得到阿泊拉霉素的抗性菌落。

2.3 供體菌和受體菌的比例

為了確定接合轉(zhuǎn)移過程中受體菌和供體菌接種最佳比例，不同比例的大腸桿菌和鏈霉菌211726孢子進(jìn)行混合涂布平板。結(jié)果（表2）表明，當(dāng)大腸桿菌與孢子的比例達(dá)到8∶1時(shí)，獲得的接合轉(zhuǎn)移子數(shù)最多。

表2 基于鏈霉菌孢子的接合轉(zhuǎn)移平板統(tǒng)計(jì)

2.4 接合轉(zhuǎn)移子的驗(yàn)證

以CP1和CP2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，并以出發(fā)菌株鏈霉菌211726基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果作為陰性對照，質(zhì)粒pSET152和pIB139的擴(kuò)增結(jié)果作為陽性對照，擴(kuò)增結(jié)果（圖1）顯示，所獲得的2株接合轉(zhuǎn)移子都可以擴(kuò)增出預(yù)測的882 bp條帶。分別回收2 株接合轉(zhuǎn)移子擴(kuò)增條帶，TA克隆后送測序，測序結(jié)果也證實(shí)了2株皆為陽性克隆子。

圖1 來自pIB139和pSET152接合轉(zhuǎn)移子的PCR驗(yàn)證

2.5 質(zhì)粒pIB139和pSET152在鏈霉菌211726接合轉(zhuǎn)移子中的穩(wěn)定性

為了檢測質(zhì)粒pIB139和pSET152在鏈霉菌211726菌株中的穩(wěn)定性，隨機(jī)挑取驗(yàn)證正確的 200個(gè)接合轉(zhuǎn)移子，發(fā)現(xiàn)它們在添加有阿泊拉霉素和無抗生素的SFMS培養(yǎng)基平板上都能生長，沒有發(fā)現(xiàn)阿泊拉霉素抗性消失的菌落。結(jié)果表明質(zhì)粒pIB139和pSET152在鏈霉菌211726菌株中可穩(wěn)定存在。

3 討論

將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方式主要有：鈣轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)化和顯微注射等。其中，接合轉(zhuǎn)移因?qū)胄瘦^高、高度跨種屬差異、價(jià)格低廉、操作方便等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于鏈霉菌研究領(lǐng)域。

質(zhì)粒是一種閉合環(huán)狀雙鏈DNA［17］，它不屬于基因組DNA，游離于染色體DNA之外。在鏈霉菌遺傳操作中人們常將其作為載體來介導(dǎo)外源DNA向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入。載體可依據(jù)其是否能整合到鏈霉菌染色體DNA上的特點(diǎn)分為整合型載體和非整合型載體，例如，整合型質(zhì)粒pIB139和pSET152［18，19］。而非整合型載體又可依據(jù)其是否含有鏈霉菌復(fù)制子分為自殺型載體和游離型載體［20］，例如游離型載體pYH7［21，22］。

在接合轉(zhuǎn)移過程中，含有外源載體的供體菌（大腸桿菌）和受體菌鏈霉菌在同一個(gè)平板上生長時(shí)，兩者之間存在不可避免的相互競爭。由于鏈霉菌的生長速度比大腸桿菌的生長速度緩慢，過量的大腸桿菌會(huì)使鏈霉菌的生長受到抑制，導(dǎo)致接合轉(zhuǎn)移率降低。因此，在建立一個(gè)新菌株的遺傳操作系統(tǒng)時(shí)摸索供體菌與受體菌之間的最佳比例就尤為重要。

4 結(jié)論

本研究通過對鏈霉菌211726抗生素敏感性測定和基于孢子和菌絲體接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的摸索，成功地將位點(diǎn)特異性整合型載體質(zhì)粒pIB139和pSET152整合到鏈霉菌211726染色體中，在分子水平證明所獲得的接合轉(zhuǎn)移子的正確性，這說明本研究建立的遺傳操作系統(tǒng)是有效可行的。

［1］ Wakesman SA, Heriei AT. The nomen culture and classification of the Actinoymcetes［J］. J Bacteriol, 1943, 46：337-341.

［2］ Kieser HM, Kieser T, Hopwood DA. A combined genetic and physical map of the Streptomyces coelicolor A3（2）chromosome［J］. J Bacteriol, 1992, 174：5496-5507.

［3］ Goodfellow M, Cross T. The Biology of the Actinomyces［M］. London：Academic Press, 1984.

［4］ Franco CM, Coutinho LE. Detection of novel secondary metabolites［J］. Crit Rev Biotechnol, 1991, 11：193-276.

［5］ Davies J. What are antibiotics? Archaic functions for modern activities［J］. Mol Microbiol, 1990, 4：1227-1232.

［6］ Morin RB, Gorman M. Chemistry and biology of beta-lactam antibiotics［M］. New York：Academic Press, 1982.

［7］ Strynadka NC, Adachi H, Jensen SE, et al. Molecular structure of the acyl-enzyme intermediate in beta-lactam hydrolysis at 1. 7 A resolution［J］. Nature, 1992, 359：700-705.

［8］Arai M. Azalomycins B and F, two new antibiotics. I. Production and isolation［J］. The Journal of Antibiotics, 1960, 13：46.

［9］Krystofova S, Varecka L, Betina V. The uptake by trichoderma viride Mycelium. correlation with growth and conidiation［J］. General Physiology and Biophysics, 1995, 14：323-338.

［10］ Yuan G, Hong K, Lin H, et al. New azalomycin F analogs from mangrove Streptomyces sp. 211726 with activity against microbes and cancer cells［J］. Marine Drugs, 2013, 11：817-829.

［11］ Yuan G, Lin H, Wang C, et al. 1H and 13C assignments of two new macrocyclic lactones isolated from Streptomyces sp. 211726 and revised assignments of azalomycins F3a, F4a and F5a［J］. Magnetic Resonance in Chemistry：MRC, 2011, 49：30-37.

［12］ Yuan GJ, Hong K, Lin HP, Li J. Azalomycin F4a2-ethylpentyl ester, a new macrocyclic lactone, from mangrove actinomycete Streptomyces sp. 211726［J］. Chinese Chemical Letters, 2010, 21：947-950.

［13］Yuan GJ, Li PB, Yang J, et al. Anti-methicillin-resistant Staphylococcus aureus assay of azalomycin F5aand its derivatives［J］. Chinese Journal of Natural Medicines, 2014, 12：309-313.

［14］Fukushima K, Arai T, Iwasaki S, et al. Studies on macrocyclic lactone antibiotics. VI. Skeletal structure of copiamycin［J］. J Antibiot（Tokyo）, 1982, 35：1480-1494.

［15］袁干軍. 產(chǎn)大環(huán)內(nèi)酯化合物的紅樹林放線菌的篩選、產(chǎn)物分離鑒定及活性研究［D］. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué), 2010：1-185.

［16］Tobias K, Bibb MJ, Mark JB, et al. Practical Streptomyces Genetics［M］. Norwich：The John Innes Foundation, 2000.

［17］Mens T, Demeyer S, Du Bois B, et al. Refactoring：Current research and future trends［J］. Electronic Notes in Theoretical Computer Science, 2003, 82（3）：483-499.

［18］Wilkinson CJ, Hughes-Thomas ZA, Martin CJ, et al. Increasing the efficiency of heterologous promoters in actinomycetes［J］. J Mol Microbiol Biotechnol, 2002, 4（4）：417-426.

［19］Del Vecchio F, Petkovic H, Kendrew SG, et al. Active-site residue, domain and module swaps in modular polyketide synthases［J］. J Ind Microbiol Biotechnol, 2003, 30（8）：489-494.

［20］Gerdes K, Rasmussen PB, Molin S. Unique type of plasmid maintenance function：postsegregational killing of plasmid-free cells［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1986, 83（10）：3116-3120.

［21］ Sun Y, He X, Liang J. Analysis of function in plasmid pHZ1358 influencing its genetic and structural stability in Streptomyces lividans 1326［J］. Applied Microbiology and Biotechnoogy, 2009, 82：303-310.

［22］Sun Y, Zhou X, Liu J, et al. Streptomyces nanchangensis, a producer of the insecticidal polyether antibiotic nanchangmycin and the antiparasitic macrolide meilingmycin, contains multiple polyketide gene clusters［J］. Microbiology, 2002, 148：361-371.

（責(zé)任編輯 李楠）

The Construction of the Gene Transfer System of Strain Streptomyces sp. 211726 Producing Azalomycin F

MA Yan-ling1LIU Fu-lai1ZHANG Min1SUN Yu-hui2HONG Kui2
（1. College of Food and Horticultural Sciences，F(xiàn)oshan University，F(xiàn)oshan 528231；2. School of Pharmaceutical Sciences，Wuhan University，Wuhan 430071）

The objective of this study is to establish the gene transfer system of strain Streptomyces sp. 211726 producing azalomycin F，which can be used for genetic manipulations such as gene knock-out and expression of foreign genes. Intergeneric genetic transfer system of Streptomyces sp. 211726 producing azalomycin F was constructed by conjugating integrative plasmid pSET152 with pIB139. Results showed that 25 mg/mL apramycin may be used to efficiently screen conjugants. PCR verification revealed that exogenous plasmid was successfully integrated in the chromosomal DNA of Streptomyces sp. 211726. The continuous passage culture experiment demonstrated that transformed pSET152 and pIB139 of conjugants were stably inherited.

azalomycin F；Streptomyces sp. 211726；conjugation；genetic stability

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.026

2015-07-23

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270120），佛山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014GA000425，2014AG10007）

馬艷玲，女，博士，研究方向：食品生物技術(shù)；E-mail：mayanling100@163.com