Pseudomonas plecoglossicida NyZ12基因無痕敲除方法的建立

毛靈琪 李存治 閆達(dá)中

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023）

Pseudomonas plecoglossicida NyZ12基因無痕敲除方法的建立

毛靈琪 李存治 閆達(dá)中

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023）

旨在建立一種適合環(huán)己胺降解菌NyZ12基因無痕敲除的可靠方法。通過overlapping PCR技術(shù)將目的基因上下游同源臂融合并克隆到自殺載體pEX18km上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17 pir中，再通過接合轉(zhuǎn)移到假單胞菌NyZ12菌株內(nèi)，經(jīng)pEX18km質(zhì)粒上sacB基因的反向篩選得到突變株并通過PCR方法和測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了假單胞菌NyZ12菌株orf4637的基因突變株（NyZ12Δ4637）。通過自殺載體同源重組可以成功獲得敲除的無痕突變株，且突變株基因組上沒有任何抗性篩選標(biāo)記殘留，為環(huán)己胺降解菌NyZ12基因功能研究提供了可靠的基因敲除技術(shù)。

基因敲除；自殺載體；同源重組；結(jié)合轉(zhuǎn)移

環(huán)己胺（cyclohexylamine，化學(xué)式C6H13N）又稱六氫苯胺，是一種重要的精細(xì)化工中間體，用于生產(chǎn)金屬緩蝕劑、殺菌殺蟲劑、橡膠硫化促進(jìn)劑和防老劑等。在生產(chǎn)和使用過程中，環(huán)己胺被釋放到環(huán)境中，可通過呼吸和皮膚進(jìn)入人體，實(shí)驗(yàn)已證實(shí)該化合物有致癌性［1］。由于環(huán)己胺在工業(yè)生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用和對(duì)人體的明顯危害性，研究對(duì)環(huán)己胺有降解作用的微生物并了解其分子機(jī)制，是消除環(huán)己胺對(duì)環(huán)境污染和殘留的有效途徑之一。

目前報(bào)道的以環(huán)己胺為碳氮源生長的純培養(yǎng)物僅有兩株，一株是Iwaki 等［2］分離篩選到的革蘭氏陽性菌Brevibacterium oxydans IH-35A，另一株是由中國科學(xué)院武漢病毒研究所周寧一［3］研究組分離的革蘭氏陰性菌Pseudomonas plecoglossicida NyZ12。

NyZ12是一株能夠利用環(huán)己胺作為唯一碳源、氮源生長的革蘭氏陰性菌株，根據(jù)其16S rRNA基因序列分析為假單胞菌屬，鑒定為變形假單胞菌Pseudomonas plecoglossicida NyZ12。這與Iwaki等分離篩選到能降解環(huán)己胺的革蘭氏陽性短桿菌Brevibacterium oxydans IH-35A不同，也是目前為止國內(nèi)第一次報(bào)道能降解環(huán)己胺的細(xì)菌。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)該菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得全基因組信息［4］。通過對(duì)比分析，預(yù)測(cè)orf4637基因可能與環(huán)己胺降解過程有關(guān)。研究基因功能的重要方法之一是構(gòu)建基因的突變體來檢測(cè)其表型的變化，以推測(cè)某個(gè)基因在生長過程中起到何種作用。其中最直接的方法是將目的基因敲除，這樣可以保證被研究的基因完全失活［5］。因此，為了進(jìn)一步研究基因orf4637的功能，本研究采用無痕敲除技術(shù)構(gòu)建Δ4637基因敲除體系。通過overlapping PCR技術(shù)［6］將目的基因上下游同源臂融合并克隆到自殺載體上，再將構(gòu)建的敲除載體轉(zhuǎn)移至受體菌，利用同源重組原理取代基因組上序列相同或非常相近的基因并使后者完全喪失功能［7］。旨在為后期對(duì)敲除突變體NyZ12Δ4637進(jìn)行表型研究，確定其在生長中是否起關(guān)鍵作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 假單胞菌NyZ12（AmpR）；E.coli S17 pir菌株（StrR）；pGEM-T Easy載體（AmpR）；自殺質(zhì)粒pEX18km（KanR），所用抗生素濃度為氨芐青霉素Amp（100 g/mL），鏈霉素Str（10 g/L），卡那霉素Kan（50 g/L）。

1.1.2 主要試劑 5×TransStart FastPfu buffer、TransStart FastPfu DNA Polymerase、2.5 mmol/L dNTPs、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I，T4 DNA Ligase均購自TaKaRa公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒（離心柱型）、基因組提取試劑盒均購自上海捷瑞生物工程有限公司。

CCMB80溶 液：KAc（1 mol/L pH8.0）1 mL，0.891 g NaCl，Glycerol 10 mL，MnCl2·4H2O（1 mol/L） 1 mL，MgCl2·6H2O（1 mol/L）1 mL，定容至100 mL，過濾除菌，冰上儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

LB培養(yǎng)基：NaCl 1 g，Tryptone 1 g，Yeast Extract 0.5 g，加水定容至100 mL，121℃下高溫滅菌20 min。

環(huán)己胺無機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO41.5 g，Na2HPO4· 12H2O 3.8 g，定容至1 L，121℃高溫滅菌；再依次加入高溫滅菌的10 mL 1 g/L CaCl2·2H2O；10 mL過濾除菌的5 g/L MgSO4·7H2O、0.2 g/L MnSO4·4H2O及0.5 g/L FeSO4·7H2O的混合體系，10 mL過濾除菌1 mol/L的環(huán)己胺鹽酸鹽溶液（pH7）。

RGMC：1% Tryptone；0.1% Yeast extract；0.8% NaCl；0.1% glucose；5 mmol/L MgCl2；5 mmol/L CaCl2。其他生化試劑均從國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司購買的分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 同源臂擴(kuò)增 設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別擴(kuò)增orf4637基因上游約700 bp及下游約900 bp大小同源臂，引物序列見表1。以環(huán)己胺降解菌NyZ12基因組DNA作為模板，引物對(duì)分別為P1/P2和P3/P4進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR體系如下：模板0.3 μL，F(xiàn)astPfu酶1 μL，5×FastPfu buffer 10 μL，上下游引物各1 μL，加無菌去離子水至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃ 2 min，98℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物。

表1 用于 4637突變株構(gòu)建及鑒定的引物

1.2.2 融合PCR反應(yīng) 純化后的同源臂片段1∶1混合，將混合DNA片段作為模板進(jìn)行融合PCR，引物對(duì)為P1/P4。PCR體系和擴(kuò)增程序同上，延伸時(shí)間延長至1 min，將純化PCR產(chǎn)物加“A”后克隆到pGEM-T Easy載體上，酶切鑒定連接正確大小片段的克隆并測(cè)序。

1.2.3 缺失突變載體的構(gòu)建 分別以EcoR I和Sal I對(duì)pEX18km質(zhì)粒和連有目的片段的pGEM-T Easy載體進(jìn)行雙酶切并經(jīng)過凝膠電泳回收。將酶切后的質(zhì)粒和目的片段按適當(dāng)?shù)谋壤旌?，加入T4連接酶在16℃連接過夜，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli S17 pir感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在37℃，180 r/min的LB培養(yǎng)基中活化1 h后，取100 μL涂布于LB平板上（StrR，KanR），37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。通過酶切鑒定篩選出含有融合片段的重組質(zhì)粒。

1.2.4 結(jié)合轉(zhuǎn)移［8］和單交換 將含重組質(zhì)粒的E.coil S17 pir接種在LB培養(yǎng)基中，環(huán)己胺降解菌NyZ12接種在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中。分別在37℃和28℃，170 r/min培養(yǎng)至OD600=0.5-0.8。隨后以供體菌（含有重組質(zhì)粒E.coil S17 pir）與受體菌（NyZ12）1∶2和1∶5的比例混合菌液，6 000 r/min離心30 s收集菌體，用100 μL RGMC將菌體洗滌兩遍，最后50 μL重新懸浮并滴加在濾膜上。待菌液被濾膜充分吸收后，將其案貼在RGMC平板上，28℃培養(yǎng)8-12 h。之后用100 μL無菌水洗滌濾膜，洗下的菌液涂布在含有氨芐青霉素和卡那霉素的雙抗LB平板上，28℃培養(yǎng)至長出單克隆菌落。根據(jù)抗性篩選和PCR鑒定，找到發(fā)生單交換菌株。

1.2.5 雙交換 挑單交換菌株接種于LB培養(yǎng)基中（AmpR），28℃，170 r/min多次傳代培養(yǎng)。傳至第4代將菌液稀釋100倍后取100 μL涂布于10%蔗糖的LB平板上，28℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。挑取單克隆接種于含有Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將過夜培養(yǎng)的菌液取4 μL分別接種于含有Amp或者含有Kan和Amp雙抗LB培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)。挑選能在Amp培養(yǎng)基中生長但不能在雙抗培養(yǎng)基中生長的單克隆進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物P1/P4和E1/E2。

將本實(shí)驗(yàn)中突變載體的構(gòu)建和交換過程分別總結(jié)為圖1、圖2。

1.2.6 測(cè)序驗(yàn)證 煮沸法［9］提取敲除菌的基因組，并以敲除菌基因組DNA作為模板，引物對(duì)分別為P1/E2進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR體系如下：模板4 μL，F(xiàn)astPfu酶1 μL，5×FastPfu buffer 10 μL，引物各1 μL，加無菌去離子水至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃ 2 min；98℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物并送至生工測(cè)序部測(cè)序。

圖1 Δ4637突變載體構(gòu)建步驟流程圖

圖2 單交換和雙交換過程

1.2.7 生長實(shí)驗(yàn) 將敲除菌與野生菌按0.5%的接種量接種于裝有50 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中，從12 h開始取樣，然后每隔1 h測(cè)定菌液OD值，繪制敲除菌與野生菌的生長曲線，比較生長狀況。

2 結(jié)果

2.1 同源臂與融合PCR

擴(kuò)增引物對(duì)P1/P2擴(kuò)增orf4637上游同源臂（約663 bp），引物對(duì)P3/P4擴(kuò)增orf4637下游同源臂（約863 bp），成功融合的片段大小為1 526 bp。1%瓊脂糖電泳結(jié)果（圖3、圖4）顯示，PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期相符，通過凝膠電泳回收得到高純度的目的片段。

圖3 PCR擴(kuò)增同源臂

圖4 PCR擴(kuò)增融合片段產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將融合片段加A后連接到pGEM-T Easy載體上，抽取質(zhì)粒并酶切鑒定，確定目的片段連接T載體上的陽性克隆測(cè)序。提取質(zhì)粒pEX18km并用EcoR I和Sal I進(jìn)行酶切，酶切后的DNA片段進(jìn)行瓊指糖電泳，結(jié)果（圖5）顯示，大小約為 6 100 bp，與標(biāo)準(zhǔn)序列大小相符。再用EcoR I和Sal I對(duì)連接目的片段的T載體片段進(jìn)行雙酶切，將兩個(gè)片段分別回收后連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pEx18km-△4637，轉(zhuǎn)化至E.coli S17 pir菌株中，抽取質(zhì)粒酶切鑒定，鑒定結(jié)果見圖6。

2.3 單交換突變體的鑒定

E.coli S17 pir與環(huán)己胺降解菌通過微孔濾膜進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移的效率比較高，重復(fù)性好。一般能在卡那霉素和氨芐青霉素抗性平板上生長的單克隆都是發(fā)生了單交換的陽性重組克隆。再挑取單菌落進(jìn)一步鑒定，分別用擴(kuò)目的基因orf4637的引物對(duì)E1/E2和基因敲除引物對(duì)P1/P4進(jìn)行PCR鑒定。用引物E1/E2擴(kuò)增有1 600 bp和120 bp左右兩條DNA片段（圖7，1、2泳道），以P1/P4擴(kuò)增有3 000 bp和1 600 bp左右兩條片段（圖8，2、3泳道）的克隆就是發(fā)生單交換的突變株。

圖5 pEx18km酶切后電泳圖

圖6 重組質(zhì)粒pEx18km-△4637酶切鑒定圖

2.4 雙交換與突變株鑒定

單交換菌株在LB培養(yǎng)基中傳4代，稀釋后涂布于含有Amp和10%蔗糖的LB平板上。由于自殺質(zhì)粒pEx18km上sacB基因突變率高，在平板上長出的單克隆也可能是單交換菌。但是雙交換菌不具備Kan抗性，單交換菌具有Kan抗性，所以利用抗性篩選，找到可能的雙交換突變體。再以該菌基因組為模板，分別用擴(kuò)目的基因orf4637的引物對(duì)E1/E2和基因敲除引物對(duì)P1/P4進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖9和圖10所示。以引物E1/E2擴(kuò)增只有120 bp大小片段（圖9，1泳道），而外側(cè)引物對(duì)P1/P4擴(kuò)增只有1 600 bp左右片段的克隆即為發(fā)生雙交換的陽性克隆，相對(duì)于單交換，無3 000 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖10，1泳道），其擴(kuò)增產(chǎn)物比以野生株為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物小了約1 400 bp，即缺失了基因編碼區(qū)。

圖7 E1/E2引物對(duì)鑒定單交換

圖8 P1/P4引物對(duì)鑒定單交換

圖9 E1/E2引物對(duì)鑒定雙交換

圖10 P1/P4引物對(duì)鑒定雙交換

2.5 敲除菌株測(cè)序結(jié)果

煮沸法提取敲除菌株基因組并利用引物P1/E2擴(kuò)增缺失區(qū)得到約750 bp大小片段，如圖11所示。

將目的片段凝膠電泳回收并送至生工測(cè)序部測(cè)序，結(jié)果如圖12所示。

圖11P1/E2引物擴(kuò)敲除片段

由于這段序列靠近測(cè)序3'端，有幾個(gè)堿基突變和缺失，可能是測(cè)序誤差。這段序列已經(jīng)跨過敲除區(qū)域，可以從兩段序列的對(duì)比發(fā)現(xiàn)orf4637基因中間缺失，說明的確發(fā)生了雙交換，orf4637成功敲除。

2.6 敲除菌生長實(shí)驗(yàn)

通過對(duì)敲除菌的生長實(shí)驗(yàn)的研究，繪制了敲除菌與野生菌的生長曲線（圖13），比較發(fā)現(xiàn)敲除orf4637突變體相對(duì)野生型在環(huán)己胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長變慢，但不是很明顯。

3 討論

目前國際上對(duì)環(huán)己胺的微生物降解研究并不多，微生物代謝環(huán)己胺的分子機(jī)理尚未揭示，因此以環(huán)己胺降解菌NyZ12為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，構(gòu)建一種可行的無痕敲除體系，成功敲除野生菌中的目的基因，對(duì)后續(xù)研究該菌的環(huán)己胺降解分子機(jī)制至關(guān)重要。利用同源重組技術(shù)敲除目的基因是目前研究基因功能最常用的定點(diǎn)突變手段，無痕敲除的主要優(yōu)勢(shì)是不需要在同源序列中插入抗性標(biāo)記基因，這樣不僅簡(jiǎn)化了敲除載體的構(gòu)建，而且減少了插入抗生素基因產(chǎn)生極性效應(yīng)對(duì)菌株生長產(chǎn)生的不良影響。同時(shí)構(gòu)建敲除載體時(shí)，SacB 基因的引入使得無痕敲除效率大大提高。SacB基因來源于枯草芽孢桿菌，編碼分泌性的蔗糖-6-果糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶催化蔗糖的水解和果聚糖的合成。在革蘭氏陰性菌中，在有蔗糖存在的情況下，基因的表達(dá)對(duì)細(xì)菌來說是致死性的［10］。

圖12 測(cè)序鑒定雙交換突變體

圖13 敲除菌的生長曲線

自殺載體pEx18km［11］不僅有反向篩選基因sacB還有Kan標(biāo)記抗性，因此發(fā)生第一次交換后，將突變株涂布于含有氨芐青霉素和卡那霉素抗性的LB平板，因?yàn)橐吧旧砭哂蠥mp抗性而E.coli S17不含Amp抗性，因此能在平板上生長的單克隆，應(yīng)該是整合了pEx18km的環(huán)己胺降解菌，也就是發(fā)生了單交換，再利用PCR方法確定，可以找到發(fā)生單交換的陽性克隆。此方法大大加快了構(gòu)建缺失株的步伐，成為整個(gè)構(gòu)建無痕突變株過程的關(guān)鍵步驟。再將多次傳代的單交換菌株，涂布于高蔗糖濃度的LB平板。利用蔗糖的選擇性壓力和細(xì)菌染色體復(fù)制過程中發(fā)生的自由重組去除載體序列，產(chǎn)生無標(biāo)記突變株［12，13］。在整合了pEx18km的環(huán)己胺降解菌中只有發(fā)生第二次交換的突變株才能在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長。抗生素抗性和sacB基因表達(dá)可作為正和負(fù)選擇標(biāo)記，但是自發(fā)的抗生素抗性、高異常重組率和基因突變可能會(huì)導(dǎo)致較高的假陽性，所以最后應(yīng)對(duì)大量突變株進(jìn)行鑒定［14］。

我們完成了環(huán)己胺降解菌NyZ12的基因組測(cè)序，預(yù)測(cè)基因組有5個(gè)胺氧化酶基因，最直接驗(yàn)證基因功能的方法是克隆表達(dá)基因，測(cè)定是否有酶活力。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明orf4637對(duì)底物環(huán)己胺有酶活力。通過基因敲除，觀察突變體的生長情況，從另一個(gè)角度回答orf4637是否參與環(huán)己胺的代謝。對(duì)NyZ12Δ4637敲除菌株進(jìn)行了生長實(shí)驗(yàn)，與野生菌對(duì)比，發(fā)現(xiàn)基本生長情況變化不明顯，所以推斷環(huán)己胺代謝途徑中催化其第一步的環(huán)己胺氧化酶可能有多個(gè)，orf4637不是主效基因。這為后續(xù)逐一敲除其他胺氧化酶基因，研究突變體的表型奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究選擇可能與環(huán)己胺降解有關(guān)的orf4637作為目的基因，選用自殺質(zhì)粒pEx18km作為載體，建立了成熟的環(huán)己胺降解菌NyZ12基因無痕敲除方法，成功構(gòu)建了假單胞菌NyZ12Δ4637基因突變株。

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（責(zé)任編輯 李楠）

A Method for Constructing Unmarked Deletion Mutants of Pseudomonas plecoglossicida NyZ12

MAO Ling-qi LI Cun-zhi YAN Da-zhong
（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023）

This study aims to establish a practical method for an unmarked gene knockout of Pseudomonas plecoglossicida NyZ12 that degrades cyclohexylamine，which is significant for further studying the molecular mechanism of it degrading cyclohexylamine. The upstream and downstream flanking DNA fragments of the target gene were fused by overlapping PCR，and then cloned into the suicide vector pEx18km. The recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain S17 pir and then transferred into NyZ12 by conjugation. The mutants by inverse screening sacB gene in pEx18km was identified by PCR and sequencing. The mutant NyZ12Δ4637 from NyZ12 strain orf4637 were successfully constructed. In conclusion，the unmarked gene-knockout mutant was acquired using homologous recombination of suicide vector，and there was no resistance residual of screening marker on the genome of the mutant. This study provides a reliable gene-knockout technology for investigating the genetic functions of NyZ12.

gene knockout；suicide vector；homologous recombination；conjugative transfer

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.027

2015-08-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270112），微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海交通大學(xué)）開放課題（MMLKF14-06）

毛靈琪，女，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：qzjsmlq@163.com

閆達(dá)中，男，博士，副教授，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：yandz6808@163.com