汪秀+李菲+黃利輝

摘要：研究油茶籽殼總黃酮（CSF）對(duì)黃曲霉毒素B1（AFB1）誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞（HL-7702）氧化應(yīng)激的保護(hù)作用及其機(jī)制。以20 μg/mL AFB1處理2 d建立HL-7702細(xì)胞AFB1損傷模型；與AFB1損傷組比較，25、50、100 μg/mL CSF預(yù)處理HL-7702細(xì)胞1 d，細(xì)胞存活率顯著上升（P<0.05），細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）和脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）水平顯著下降（P<0.05），超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性顯著升高（P<005），核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）及其下游谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A2（GSTA2）的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）及下游炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.05）。因此，油茶籽殼總黃酮通過上調(diào)Nrf2，提高Nfr2下游抗氧化酶系的活性，阻斷了由ROS引起的脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，同時(shí)下調(diào)NF-κB，減少炎癥因子相關(guān)基因的表達(dá)，從而拮抗AFB1對(duì)肝細(xì)胞的毒性損傷，提高了肝細(xì)胞存活率。

關(guān)鍵詞：油茶籽殼；總黃酮；黃曲霉毒素B1；氧化應(yīng)激；細(xì)胞保護(hù)

中圖分類號(hào)： R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0308-04

由黃曲霉、寄生曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素B1（AFB1）經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)于發(fā)霉變質(zhì)的飼料、食物中，被認(rèn)為是中毒性最強(qiáng)、危害最大的一種霉菌毒素[1]。生物體攝入AFB1后，在不同器官誘發(fā)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS），破壞機(jī)體的氧化-抗氧化平衡，從而使脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）積累，對(duì)脂類、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子造成損傷[2]，由此形成的氧化應(yīng)激對(duì)肝臟的損傷是最大的[3]。研究表明，植物黃酮類物質(zhì)能吸收包括AFB1在內(nèi)的多種霉菌毒素，減輕其對(duì)動(dòng)物體的損傷，保護(hù)肝臟，從而改善牲畜健康，提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量。人參皂苷[4]、槲皮苷[5]、柚皮苷[6]、藤黃雙黃酮[7]等都被發(fā)現(xiàn)具有黃曲霉毒素細(xì)胞保護(hù)作用。然而，至今仍然沒有一種商業(yè)化的AFB1生物保護(hù)劑，主要是由于上述具有細(xì)胞保護(hù)作用的化合物來源十分有限，價(jià)格昂貴。因此，尋找易獲得、廉價(jià)的此類化合物來源（如農(nóng)副產(chǎn)品）十分必要。我國是世界上油茶籽產(chǎn)量最大的國家，油茶籽殼是油茶籽榨油前除去的種皮，大量的廢棄茶籽殼一般被丟棄或用作燃料，既污染環(huán)境又浪費(fèi)資源。研究表明，油茶籽殼中含有豐富的黃酮類物質(zhì)[8]，關(guān)于這類黃酮類物質(zhì)提取工藝的研究已經(jīng)很多，但對(duì)其功能研究目前僅局限在證明其具有較好的體外抗氧化性能[9-10]。因此，筆者推測(cè)油茶籽殼中的黃酮類物質(zhì)所具有的抗氧化能力可以減輕AFB1對(duì)細(xì)胞的毒性作用。本研究采用AFB1最易損傷的正常肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞為材料，建立AFB1肝細(xì)胞損傷模型，探討油茶籽殼中黃酮類物質(zhì)對(duì)AFB1肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，旨在為油茶籽殼的綜合高效利用和天然AFB1生物保護(hù)劑開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 油茶籽殼總黃酮（CSF）樣品制備

油茶籽購自浙江省嘉興市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，剝殼后自然曬干即得油茶籽殼，粉碎后備用。取5 g油茶籽殼粉碎樣品，依照姜天甲等[9]和高揚(yáng)等[11]的方法，按1 g ∶30 mL比例加入60%乙醇溶液，浸泡30 min，40 ℃超聲波提取45 min，濾液減壓濃縮后加蒸餾水定容至50 mL，加等體積石油醚充分振蕩，靜置分層后分離收集，經(jīng)40 ℃真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，制備得油茶籽殼總黃酮并用DMSO配成20 mg/mL儲(chǔ)備液，-20 ℃保存。

1.2 材料

人正常肝細(xì)胞系HL-7702購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；AFB1、DMSO、MTT均為Sigma公司產(chǎn)品，AFB1溶解于DMSO 中，配成1 mg/mL母液；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶、青鏈霉素均為HyClone公司產(chǎn)品；胎牛血清購于四季青公司；MDA試劑盒，SOD、CAT、GSH-Px測(cè)定試劑盒購于南京建成工程研究所；ROS檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PCR試劑盒、TRIzol、脫脂牛奶（BSA）均為碧云天公司產(chǎn)品；PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司；小鼠抗人Nrf2、GSTA2、β-actin單克隆抗體均為Santa Cruz公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購于武漢博士德生物公司；PCR引物均合成自上海博尚生物公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人HL-7702正常肝細(xì)胞以RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.3.2 AFB1致HL-7702細(xì)胞損傷模型建立 采用MTT法檢測(cè)HL-7702細(xì)胞增殖抑制率，試驗(yàn)分為對(duì)照組和AFB1組。HL-7702細(xì)胞按5 000個(gè)細(xì)胞/孔接入96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，過夜培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后加化合物。對(duì)照組每孔加入含1%DMSO的完全培養(yǎng)基100 μL，AFB1組每孔加入含5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL AFB1的完全培養(yǎng)基100 μL。各組分別培養(yǎng)0.5、1、2 d后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，并加入100 μL含 MTT溶液（終濃度0.5 mg/mL）的無血清培養(yǎng)基，避光37 ℃孵育4 h，棄上清液，每孔加100 μL DMSO，振蕩使結(jié)晶物充分溶解，570 nm下測(cè)定各孔吸光度，細(xì)胞抑制率=（D對(duì)照-D試驗(yàn)）/ D對(duì)照×100%。根據(jù)MTT結(jié)果，選擇AFB1的最佳濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 油茶籽殼總黃酮對(duì)AFB1致細(xì)胞損傷的預(yù)保護(hù)試驗(yàn) 細(xì)胞接板和MMT檢測(cè)方法同“1.3.2”節(jié)，試驗(yàn)分組如下：設(shè)正常對(duì)照組、AFB1模型組和油茶籽殼總黃酮低劑量、中劑量、高劑量保護(hù)組。正常對(duì)照組：細(xì)胞先用含1%DMSO（CSF的溶劑）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，換液后再加入含1%DMSO（AFB1的溶劑）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d；AFB1模型組：細(xì)胞先用含1%DMSO（CSF的溶劑）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，換液后加入含有最佳損傷濃度AFB1（20 μg/mL）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d；CSF保護(hù)組：細(xì)胞先分別與含25、50、100 μg/mL CSF的完全培養(yǎng)基預(yù)孵1 d，換液后加入含有最佳損傷濃度AFB1（20 g/mL）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d。3 d培養(yǎng)結(jié)束后檢測(cè)細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

細(xì)胞存活率=D試驗(yàn)/ D對(duì)照×100%。（1）

1.3.4 HL-7702細(xì)胞內(nèi)MDA生成量的檢測(cè) 采用 “1.3.3”節(jié)所述方法處理HL-7702細(xì)胞，用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定MDA含量[12]。將各組細(xì)胞裂解后按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行操作，在532 nm處測(cè)定各孔吸光度，采用BCA試劑盒說明書規(guī)定的方法測(cè)定總蛋白濃度。

1.3.5 HL-7702細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測(cè) 采用 “1.3.3”節(jié)所述方法處理HL-7702細(xì)胞，采用二氯熒光素雙乙酸（DCFH-DA）法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將各組細(xì)胞裂解后按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行，細(xì)胞裂解液與10 nmol/L DCFH-DA 37 ℃孵育30 min后，PBS洗細(xì)胞2次。熒光強(qiáng)度用熒光酶標(biāo)儀以激發(fā)波長485 nm 和發(fā)射波長535 nm檢測(cè)。ROS相對(duì)含量計(jì)算公式如下：

ROS相對(duì)含量=處理組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度×100%。（2）

1.3.6 HL-7702細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系含量測(cè)定 采用 “1.3.3”節(jié)所述方法處理HL-7702細(xì)胞，收集各組細(xì)胞，用冰PBS洗，然后在冰上用超聲破碎機(jī)200 V、30 s，間隔5 s，3次破碎細(xì)胞，取100 L細(xì)胞裂解液，按照試劑盒說明書操作步驟測(cè)定SOD、CAT、GSH-Px酶活性。酶活性以酶比活力單位（U/mg）表示，并用細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量作校正。

1.3.7 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的改變 采用 “1.3.3”節(jié)所述方法處理HL-7702細(xì)胞，收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，采用PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到各組細(xì)胞cDNA。PCR擴(kuò)增條件均為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 8 min；循環(huán)數(shù)30。最后PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳分離，檢測(cè)基因引物見表1，GAPDH為內(nèi)參。

1.3.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)的改變 采用 “1.3.3”節(jié)所述方法處理HL-7702細(xì)胞，收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，加入裂解液，冰上充分裂解1 h，總蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用稀釋的Nrf2、GSTA2和標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參β-actin一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加稀釋的二抗室溫孵育2 h，加ECL發(fā)光試劑，顯影、定影。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用x±s表示，采用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncans檢驗(yàn)多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 HL-7702細(xì)胞AFB1受損模型的建立

由圖1可見，AFB1對(duì)HL-7702的細(xì)胞毒性呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性。0.5、1 d組各濃度雖也可以明顯抑制細(xì)胞增殖，但彼此之間差異不大，2 d組各濃度對(duì)應(yīng)的細(xì)胞抑制率之間差異明顯，且濃度與抑制率之間相關(guān)性好（r2=0.99），因此以2 d組數(shù)據(jù)確定AFB1的IC50濃度為20 μg/mL，以 此 作 為AFB1對(duì)HL-7702細(xì)胞損傷模型的最佳濃度。

2.2 油茶籽殼總黃酮對(duì)AFB1損傷的HL-7702細(xì)胞存活率的影響

將未經(jīng)油茶籽殼總黃酮預(yù)處理的HL-7702細(xì)胞暴露于20 μg/mL AFB1 2 d，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率明顯下降（表2）。經(jīng)25、50、100 μg/mL油茶籽殼總黃酮預(yù)保護(hù)過的HL-7702細(xì)胞再接受相同樣劑量AFB1暴露相同時(shí)間后，細(xì)胞存活率較AFB1損傷組明顯提高，且其保護(hù)效果呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系。油茶籽殼總黃酮對(duì)HL-7702細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可以有效抑制AFB1造成的細(xì)胞增殖抑制。

2.3 HL-7702細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA水平的改變

由表3可知，與對(duì)照組相比，20 μg/mL AFB1作用HL-7702細(xì)胞2 d，顯著增加了HL-7702細(xì)胞內(nèi)ROS活性和MDA含量，說明AFB1造成了HL-7702細(xì)胞的氧化損傷。經(jīng)25、50、100 μg/mL油茶籽殼總黃酮預(yù)處理后，受損細(xì)胞內(nèi)的ROS活性逐漸降低，與AFB1損傷組相比差異顯著，MDA含量也隨著油茶籽殼總黃酮濃度升高而顯著下降。

2.4 HL-7702細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系的改變

由表4可見，與對(duì)照組相比，20 μg/mL AFB1作用HL-7702細(xì)胞2 d，顯著降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性，說明細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)。經(jīng)25、50、100 μg/mL油茶籽殼總黃酮預(yù)處理HL-7702細(xì)胞1 d，與AFB1損傷組相比，25 μg/mL保護(hù)組沒有顯著提升HL-7702細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH-Px活性。

2.5 HL-7702細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其下游抗氧化酶表達(dá)的改變

Nrf2被稱為氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子[16]。與對(duì)照組相比，AFB1損傷組Nrf2及其下游GSTA2的mRNA（圖2-a）和蛋白表達(dá)水平（圖2-b）均明顯下調(diào)。隨著油茶籽殼總黃酮預(yù)保護(hù)濃度的提高，與AFB1損傷組相比，Nrf2及GSTA2的mRNA和蛋白表達(dá)水平都呈現(xiàn)劑量依賴性上調(diào)。GSTA2是Nrf2調(diào)控的下游眾多抗氧化蛋白之一，SOD、CAT、GSH-Px也受Nfr2的調(diào)控，由此可知，油茶籽殼總黃酮在細(xì)胞氧化應(yīng)激的情況下，通過上調(diào)Nrf2表達(dá)，提高了其下游一系列抗氧化酶的活性，從而對(duì)抗由AFB1造成的細(xì)胞氧化損傷。

2.6 細(xì)胞內(nèi)NF-κB及下游炎癥因子mRNA表達(dá)的改變

研究表明，肝細(xì)胞遭受氧化受損及肝炎、肝癌發(fā)生時(shí)NF-κB信號(hào)通路被顯著激活[17-18]。由圖3可知，與對(duì)照組相比，AFB1損傷組核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)明顯上調(diào)，其相關(guān)下游炎癥介導(dǎo)因子TNF-α、IL-6、IL-1β也隨之高表達(dá)，隨著油茶籽殼總黃酮預(yù)保護(hù)濃度的提高，與AFB1損傷組相比，NF-κB及炎癥因子表達(dá)都呈現(xiàn)劑量依賴性下調(diào)。由此可知，油茶籽殼總黃酮對(duì)HL-7702細(xì)胞的預(yù)處理下調(diào)了由AFB1引起的NF-κB信號(hào)通路的激活，相關(guān)炎癥因子表達(dá)隨之減少，提示其在預(yù)防、治療肝炎方面可能具有的功能。

3 結(jié)論與討論

生物有氧代謝過程中產(chǎn)生的過多活性氧（ROS）會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，肝臟因含有豐富的線粒體，是產(chǎn)生ROS較多的器官，也是較易受到ROS攻擊的器官。氧化應(yīng)激會(huì)引起脂質(zhì)過氧化，破壞酶活性，損傷DNA，造成肝損傷。研究表明，氧化應(yīng)激與多種肝臟疾病、肝功能障礙密切相關(guān)[19]。AFB1進(jìn)入肝細(xì)胞后，通過環(huán)氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腁FB1-8，9環(huán)氧化合物，進(jìn)而引發(fā)肝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量ROS，造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激，這是AFB1生物毒性尤其是肝臟毒性發(fā)生的主要機(jī)理[20]。

本研究表明，當(dāng)肝細(xì)胞遭遇AFB1損傷時(shí)，油茶籽殼總黃酮與肝細(xì)胞的預(yù)孵顯著降低了細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平，同時(shí)提升了肝細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系（SOD、CAT、GSH-Px）的活性，因此改善了肝細(xì)胞AFB1暴露下的氧化-抗氧化平衡環(huán)境，提高了細(xì)胞存活率。El-Nekeety 等[3]、 Zhang等[21]、Hou等[22]都曾報(bào)道過：當(dāng)細(xì)胞暴露于霉菌毒素時(shí)，天然抗氧化劑可以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，阻斷脂質(zhì)過氧化，從而緩解細(xì)胞的氧化應(yīng)激。Nrf2是公認(rèn)的細(xì)胞防御過氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2與細(xì)胞核內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合，上調(diào)一系列解毒酶和抗氧化蛋白表達(dá)，從而增強(qiáng)肝細(xì)胞的解毒及抗氧化能力，減輕活性氧（ROS）和親電子物質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞損害，對(duì)保護(hù)肝臟功能、阻止多種肝臟疾病的發(fā)生有著重要意義[23]。已經(jīng)證明能通過Nrf2途徑改善肝細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞作用的化合物有白藜蘆醇[24]、姜黃素[25]、齊墩果酸[26]、熊去氧膽酸[27] 等，這些化合物主要集中在對(duì)肝細(xì)胞的乙醇或其他藥物損傷方面的保護(hù)，由于這些化合物的來源十分有限，限制了其更為廣泛的應(yīng)用。本研究表明，來自油茶籽殼中的總黃酮物質(zhì)與肝細(xì)胞的預(yù)孵上調(diào)了Nrf2、GSTA2表達(dá)，GSTA2是Nrf2調(diào)控的下游眾多抗氧化蛋白之一，與肝臟解毒功能有關(guān)，SOD、CAT、GSH-Px也受Nfr2調(diào)控，抗氧化酶是細(xì)胞內(nèi)對(duì)抗ROS的主要防御機(jī)制，因此可以認(rèn)為油茶籽殼總黃酮預(yù)處理肝細(xì)胞后激活了Nfr2信號(hào)通路，上調(diào)其下游多種抗氧化酶基因的表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，從而對(duì)抗由ROS引起的肝細(xì)胞氧化損傷，起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用。Costa等也報(bào)道了黃酮類物質(zhì)在上調(diào)Nrf2蛋白和提高抗氧化酶活性方面的重要作用[28]。

細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量ROS除了會(huì)導(dǎo)致MDA積累外，還可激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而使其下游調(diào)控的許多炎癥因子（包括TNF-α等）表達(dá)增加，持續(xù)釋放，肝細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡，炎癥細(xì)胞大量浸潤，最終導(dǎo)致肝炎甚至引發(fā)肝癌[29] 。本研究表明，油茶籽殼總黃酮的預(yù)處理使得肝細(xì)胞NF-κB表達(dá)下降及其調(diào)控的炎癥因子（TNF-α、 IL-6、IL-1β）下調(diào)，這提示其在預(yù)防、治療肝炎方面可能具有的功能。油茶籽殼總黃酮通過上調(diào)Nrf2，提高Nfr2下游抗氧化酶系（SOD、CAT、GSH-Px、GSTA2）的活性，阻斷了由ROS引起的脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，同時(shí)下調(diào)NF-κB，減少炎癥因子相關(guān)基因（TNF-α、IL-6、IL-1β）的表達(dá)，從而拮抗AFB1對(duì)肝細(xì)胞的毒性損傷，提高肝細(xì)胞存活率。油茶籽殼作為一種農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，在我國資源豐富、價(jià)格低廉，本研究證明了其中的黃酮類物質(zhì)具有拮抗AFB1肝細(xì)胞毒性的功能，為油茶籽殼的環(huán)保、高效利用提供了新途徑。

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