劉苑星
摘要:采用乙醇回流提取法提取昆侖雪菊中的總黃酮物質,選取大孔樹脂分離純化昆侖雪菊中的總黃酮,用蘆丁標準品制標準曲線檢測總黃酮含量,回歸方程為A=15.508C-0.0044,R2=0.9995。乙醇回流提取液中總黃酮含量為9.04%。通過MTT法測定黃酮對腫瘤細胞增殖的影響,記錄統(tǒng)計實驗數(shù)據,抑制率=1-(實驗組A值一空白組A值)/(對照NA值一空白組A值)。抑制率≥30%判定藥物敏感試驗為陽性,抑制率≤30%判定藥物敏感試驗為陰性。
關鍵詞:昆侖雪菊;總黃酮;腫瘤細胞;抑制率
前言
昆侖雪菊為新疆特有植物,學名雙色金雞菊,屬菊科金雞菊一年生草本植物,是具有降血壓、降血脂等獨特功效的稀有高寒植物,具有極高的藥用價值。昆侖雪菊中的總黃酮含量高達12%,遠超其他菊類。其富含的總黃酮具有多方面功效。其中,黃酮作為一種較強的抗氧化劑,其抗氧化能力是維生素E的10倍以上,可有效增強生物對病原體的抵抗能力,清除體內的氧自由基,從而起到阻止細胞衰老、癌變的作用。因此昆侖雪菊中富含的總黃酮具有免疫調節(jié)的功能,是調節(jié)血糖、降低血壓血脂、抗衰老及癌變等有關藥物中重要的物質。
目前,對于昆侖雪菊的植物分類學生物生態(tài)學特性等方面,國內外的研究開發(fā)報道較多,除此之外對其研究甚少,尤其是藥理學方面,僅見其降血壓、降血脂、抗氧化、微循環(huán)及抗凝血作用的研究。有關昆侖雪菊對腫瘤細胞影響的研究,目前鮮見報道。為進一步探討昆侖雪菊中黃酮物質的抗腫瘤活性研究,首先從昆侖雪菊中提取總黃酮,進一步研究昆侖雪菊中總黃酮對腫瘤細胞增殖抑制作用,不僅為開發(fā)和綜合利用昆侖雪菊資源提供一定的理論依據,更為中藥治療腫瘤疾病的新藥奠定理論與實踐基礎。
1藥物與儀器
昆侖雪菊(2015年10月采自新疆和田地區(qū)昆侖山區(qū)),紫外可見分光光度計,電子天平,電熱恒溫水浴鍋,水循環(huán)真空泵,旋轉蒸發(fā)器,蘆丁標準品,亞硝酸鈉,硝酸鋁,乙醇,氫氧化鈉等均為AR級。
2實驗方法
2.1分離提取昆侖雪菊中的黃酮
乙醇回流提取液:用適量體積分數(shù)95%的乙醇浸泡昆侖雪菊粉末48h,將抽濾所得液體在溫度45℃條件下,用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)4h,提取液轉移到250ml容量瓶中,并定容到刻度,再取10ml溶液置50ml容量瓶中定容至刻度液。
2.2昆侖雪菊提取液的純化
取15g大孔樹脂,用95%乙醇浸泡24h。取10g大孔樹脂裝柱,用95%乙醇沖洗,沖洗至沖洗液與蒸餾水以1:4混合不顯白色渾濁為止。將沖洗好的大孔樹脂倒入昆侖雪菊粗提物中,搖床震蕩24h。將震蕩好的粗提物進行抽濾,上層固體用95%乙醇浸泡24h,下層液體密封冷藏備用。次日將浸泡好的固體進行抽濾,抽濾所得下層液體在45℃條件下旋蒸1.5h,所得粘稠液體經稱量為9.13g,冷藏備用。測得總黃酮含量為68.04%。
2.3蘆丁標準溶液的制備
(一)對照品溶液的制備
精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品50mg,置于50mL容量瓶中,加甲醇35mL,置水浴上微熱使其溶解,放冷,加甲醇至刻度,搖勻。精密吸取5mL,置于50mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻,即得(每1mL中含有無水蘆丁0.1mg)。
(二)標準曲線的制備
分別按照0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml濃度梯度量取對照品溶液(0.1mg/ml),并置于10ml容量瓶,各加30%乙醇使成5.0ml,各精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3ml,充分搖勻,放置8分鐘。各精密加入10%硝酸鋁溶液0.3ml,充分搖勻,放置8分鐘。各加lmol/L氫氧化鈉溶液4.0ml,用蒸餾水稀釋至刻度,充分搖勻,放置16分鐘,用分光光度計,在510nm波長處測定其吸光度。分別以濃度、吸光度為橫、縱坐標,繪制標準曲線圖。
2.4提取液中總黃酮含量的測定
量取不同提取液100ml置于25ml容量瓶,加水至6ml,以相應溶液為空白對照組,根據以上方法配制樣品溶液,在510nm波長處測定A值。代入回歸方程后得出結果,見表1。
2.5 MTT法測定黃酮對腫瘤細胞活性的影響
采用MTT法檢測樣品對MCF7細胞增殖的抑制作用。將MCF7細胞分別以3x104個/ml接種于96孔培養(yǎng)板中,加入培養(yǎng)液,在37℃飽和濕度、5%C02條件下孵育24h,24h后觀察細胞貼壁的情況。取出每孔的培養(yǎng)液,按照梯度濃度0、25、50、100、200、400、600μg/ml向每組各孔中加入昆侖雪菊提取液的培養(yǎng)溶液,同時向對照組加入相同濃度得DMSO,陽性對照組每組為4個孔,向每孔加入順鉑(20g/μl),在37℃飽和濕度、5%C02條件下孵育48、72、96h,在培養(yǎng)結束4h前,向每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸去孔中的上清液,向每孔加入DMS0150μl,置于搖床上低速振蕩,在結晶物充分溶解后,用DNM-9602G型酶聯(lián)免疫檢測儀(OD510nm)測每孔的吸光度值,由公式可得細胞增值抑制率,抑制率=1-(實驗組A值一空白組A值)/(對照組A值一空白組A值),抑制率≥30%判定藥物敏感試驗為陽性,抑制率≤30%判定藥物敏感試驗為陰性。
3結果與分析
按照濃度梯度0、25、50、100、200、400、600μg/ml,將不同濃度的昆侖雪菊提取液作用于MCF7細胞,孵育72h后,觀察不同濃度的昆侖雪菊提取液樣品對MCF7細胞增殖的影響,并記錄數(shù)據。由表2知,昆侖雪菊總黃酮粗提物對MCF7細胞有抑制作用,其IC50為372.59μg/ml,增大濃度,細胞增殖的抑制率也隨之增大,因此昆侖雪菊總黃酮粗提物對MCF7細胞生長抑制影響呈劑量依賴性。通過與提取物的IC50比較,昆侖雪菊總黃酮的純化物對MCF7細胞增值具有抑制作用。
4結論與討論
由于目前主流的治療癌癥方法的缺陷很大,因此國內外科學家們開始將研究抗腫瘤藥物的目光移至天然產物上,其中包括從中草藥中提取抗腫瘤活性強的物質。本研究中,用乙醇回流提取法提取昆侖雪菊黃酮類化合物。利用可見紫外分光光度法對昆侖雪菊藥材中總黃酮的含量進行測定。選用蘆丁為對照品,選擇測定波長510nm,制作標準曲線和回歸方程,再通過樣品吸收度值計算含量結果發(fā)現(xiàn),昆雪菊總黃酮在濃度為0.01~0.08mg/mmL的范圍內具有良好的線性關系。
該研究采用MTT法檢測昆侖雪菊總黃酮粗提取物對細胞增殖的影響。由最終結果可得,昆侖雪菊總黃酮粗提物對MCF7細胞增值具有抑制作用?;罴毎壤S樣品濃度加大逐漸減少,細胞凋亡發(fā)生率明顯上升。綜上,昆侖雪菊總黃酮純化物對MCF7細胞有很好的抑制作用,其機制可能與其誘導細胞有關。
本課題研究昆侖雪菊中總黃酮對腫瘤細胞活性抑制作用,在以后的研究中,還應就具體增值抑制作用機理展開具體研究。