肖雪琴,賴　劍,羅耀玲,王華彬,方玉蘭,黃淑芳

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院　1.兒科;2.胃腸外科;3.科研中心，江西　贛州　341000)

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雙黃連逆轉(zhuǎn)肺炎克雷伯菌耐藥的體內(nèi)效果初探

肖雪琴1,賴劍2,羅耀玲3,王華彬1,方玉蘭1,黃淑芳1

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院1.兒科;2.胃腸外科;3.科研中心，江西贛州341000)

摘要：目的:探討雙黃連逆轉(zhuǎn)肺炎克雷伯菌耐藥的體內(nèi)效果。方法：建立耐藥的SD大鼠肺炎克雷伯菌模型；再隨機分4個治療組：PBS組、雙黃連組、頭孢他啶組及聯(lián)合治療組；治療3天后觀察各組臨床表現(xiàn)，并測定各組大鼠肺內(nèi)活菌數(shù)，以及這些活菌對頭孢他啶的藥敏效果。結果：臨床表現(xiàn)和病理切片結果表明耐藥肺炎克雷伯菌大鼠建模成功；各組治療結果表明，聯(lián)合治療組大鼠在臨床表現(xiàn)上痊愈，肺內(nèi)活菌數(shù)及活菌的MIC與兩個單獨治療組和PBS對照組相比顯著減少(P<0.01)，而兩個單獨治療組的大鼠在臨床表現(xiàn)上基本無好轉(zhuǎn)，肺內(nèi)活菌數(shù)及活菌的MIC與PBS組相比相對減少，差異不大。結論：中藥雙黃連可降低肺炎克雷伯菌大鼠的耐藥。

關鍵詞：雙黃連；耐藥肺炎克雷伯菌；逆轉(zhuǎn)

小兒肺炎是兒科最常見的呼吸系統(tǒng)疾病，易反復發(fā)作和引起多種嚴重的并發(fā)癥，影響兒童發(fā)育[1]。小兒肺炎的病原體主要為細菌、病毒、支原體和衣原體，我國以細菌感染為主[2]，其中60%以上是革蘭陰性菌，25%～30%為革蘭陽性菌。革蘭陰性菌中以肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌為主[3-4]，為此課題選擇克雷伯菌作為實驗菌株。近年來由于抗生素的廣泛使用甚至濫用，使細菌在這種持續(xù)脅迫的選擇壓力下，產(chǎn)生了嚴峻的耐藥現(xiàn)象。研究顯示肺炎克雷伯菌對多種抗生素尤其是碳青霉烯類抗生素有非常嚴重的耐藥現(xiàn)象[5],為此不少研究者將目光投向了耐藥逆轉(zhuǎn)劑上。 近年來，一些學者[6-8]將中藥作為逆轉(zhuǎn)劑逆轉(zhuǎn)抗生素耐藥，在體外研究上取得了良好的效果，然而并未做過體內(nèi)實驗。本課題選擇中藥雙黃連作為逆轉(zhuǎn)劑，研究其對耐頭孢他啶的肺炎克雷伯菌的體內(nèi)逆轉(zhuǎn)效果?，F(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1材料頭孢他定藥敏片(英國OXOID)，M-H培養(yǎng)基(英國OXOID)。雙黃蓮粉針劑(哈藥集團中藥二廠)，頭孢他定(Glaxo Smithkline公司，批號C076348，純度89．4%)。

1.2耐藥菌株的來源和培養(yǎng)選擇贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院臨床分離的耐藥肺炎克雷伯菌株(用頭孢他定藥敏片進行藥敏實驗，抑菌圈直徑≤22 mm的菌株，定為耐藥菌株)。將菌株劃線于M-H瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃大量培養(yǎng)過夜，用PBS沖洗菌臺并稀釋調(diào)配成1×109CFU·mL-1備用。

1.3SD大鼠肺炎模型的建立和驗證[9]選擇清潔級SD大鼠30只，雌雄各半，體重130～180 g(由贛南醫(yī)學院動物中心提供)。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，鼻部緩緩滴入約1×109CFU·mL-1肺炎克雷伯菌30 μL，分2次接種，大鼠保持直立體位20 s，以確保菌液順利進入肺部組織。觀察感染12 h、24 h大鼠的臨床表現(xiàn)，并與感染24 h后從中隨機挑選3只處死進行肺組織病理學檢測。

1.4肺部感染的SD大鼠分組與治療將SD肺炎大鼠隨機分4組，每組6只，分別為：PBS對照組、頭孢他定治療組、雙黃連組、頭孢他定與雙黃連聯(lián)合治療組；雙黃蓮按23 g·L-1,頭孢他啶200 mg·kg-1，每只分別灌胃0.5 mL；對照組灌胃給予等量的PBS，每天灌胃2次，時間間隔為6～8 h，連續(xù)治療3天。記錄各組大鼠臨床表現(xiàn)。

1.5細菌計數(shù)最后一次治療后12 h處死鼠，取雙肺，PBS沖洗3次，置勻漿器中加入2 mL PBS研磨15 min，制成肺組織勻漿。采用10×倍比稀釋肺組織勻漿，依次取各濃度100 μL接種M-H瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫孵育24 h，選取菌落在20～200個之間的平板進行菌落計數(shù)。

1.6藥敏實驗測定MIC選擇1.5步驟中各組活菌，每管細菌最終接種量為1×106CFU·mL-1，采用試管2倍稀釋法測定頭孢他啶對各組活菌的最小抑菌濃度(MIC)。

2結果

2.1肺炎克雷伯菌大鼠模型驗證SD大鼠感染肺炎克雷伯菌臨床表現(xiàn)可見：12 h時，大鼠出現(xiàn)煩躁、活動增強，體溫升高達39.4 ℃；感染24 h時，大鼠出現(xiàn)蜷縮不動、呼吸緩慢、弓背、反應遲鈍、皮毛蓬松、食欲下降、攝食差。 病理學檢測： 感染24 h的SD大鼠與未感染的SD大鼠相比，病理切片顯示： 感染的大鼠肺間隔變寬，肺泡變的不規(guī)則，很多出現(xiàn)融合斷裂。高倍鏡顯示：支氣管周圍、肺泡壁充血，見圖1。

A.感染的肺部組織B.未感染的正常肺部組織

圖1 SD大鼠肺部組織病理切片圖

2.2治療3天后各組SD大鼠的臨床表現(xiàn)PBS組于治療第二天死亡2只，未死亡大鼠蜷縮飼養(yǎng)籠不動，眼睛緊密；雙黃連組和頭孢他啶組大鼠皮毛仍蓬松、食欲仍不佳，體溫仍很偏高，約38.5 ℃，精神略好轉(zhuǎn)；聯(lián)合治療組的大鼠毛發(fā)已有光澤，食欲大好，體溫正常。

2.3細菌計數(shù)結果每100 μL中細菌計數(shù)結果如圖2：PBS組為(13.5±2.38) CFU,雙黃連組為(9.33±1.36) CFU，頭孢他啶組為(10±1.41) CFU，雙黃連與頭孢他啶聯(lián)合組為(3.67±1.21) CFU，方差分析結果表明，三個治療組與PBS對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；雙黃連組和頭孢他啶組相比，治療效果無統(tǒng)計學差異(P=0.468)；聯(lián)合治療組與兩個單獨治療組相比，差異顯著(P<0.01)。

圖2細菌計數(shù)

2.4MIC測定結果見表1。雙黃蓮與頭孢他啶聯(lián)合治療組MIC明顯比其他治療組低(P<0.01)，可見雙黃連可降低頭孢他啶的MIC，逆轉(zhuǎn)肺炎克雷伯菌的耐藥。

表1　頭孢他啶對各組肺炎克雷伯菌的MIC

*與其他各組比較，P<0.01。

3 討論

降低肺炎克雷伯菌耐藥，使其全部或部分恢復對抗生素的敏感性，對臨床治療肺炎有重要的意義，肺炎克雷伯菌耐藥的主要原因是它利用固有耐藥基因或從外源獲得的耐藥基因通過以下5種方式產(chǎn)生耐藥：(1) 產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶；(2)通過膜上某種蛋白發(fā)生改變使抗生素出現(xiàn)滲透障礙；(3)通過改變靶位酶，使其不被抗生素所作用；(4)通過主動外排系統(tǒng)，將藥物泵出細胞外；(5)通過增加對抗菌藥物拮抗物的產(chǎn)量而耐藥。科研工作者根據(jù)這些耐藥機制研究逆轉(zhuǎn)劑，早期開發(fā)了β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如克拉維酸(clavulanic acid)，舒巴坦(sulbactam)來逆轉(zhuǎn)耐藥，然而這些逆轉(zhuǎn)劑會再次產(chǎn)生耐藥，并促進超級耐藥菌的產(chǎn)生。

近年來研究表明中藥可以從不同方面抑制耐藥，并且不易產(chǎn)生耐藥性，如黃芩可以抑制β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生[6]，大黃可消除金葡菌抗生素耐藥質(zhì)粒[10]；因此開發(fā)中草藥作為細菌耐藥的逆轉(zhuǎn)劑具有廣闊的應用前景。

本課題選擇雙黃連粉針劑(主要成分為金銀花、黃芩、連翹，具有清熱解毒功效)作為逆轉(zhuǎn)劑，研究其對耐肺炎克雷伯菌大鼠的逆轉(zhuǎn)效果。為了避免中藥的抑菌作用，單純考慮雙黃連對細菌的逆轉(zhuǎn)效果，課題中雙黃連和頭孢他啶的治療劑量均為略低于最小抑菌量(由預實驗確定)。實驗中治療3天后，雙黃連和頭孢他啶治療組大鼠在臨床表現(xiàn)上基本沒什么好轉(zhuǎn)，而聯(lián)合治療組大鼠痊愈；細菌計數(shù)結果則表明雙黃蓮和頭孢他啶聯(lián)合治療組比兩個單獨治療組細菌數(shù)明顯降低；這些結果均表明雙黃連可以逆轉(zhuǎn)肺炎克雷伯菌對頭孢他啶的耐藥。

中藥逆轉(zhuǎn)抗生素耐藥體外效果明顯，本課題初步研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)效果也很明顯。隨后我們將通過進一步的研究給予確認，并進行耐藥機制的研究。

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Study on Reversal of Effect of Double Coptis in Vivo on the Resistance of Klebsiella Pneumoniae

XIAOXue-qin1,LAIJian2,LUOYao-ling3,WANGHua-bin1,FANGYu-lan1,HUANGShu-fang1

(1.Dept.ofPediatrics;2.Dept.ofGastrointestinalSurgery;3.ScientificResearchCenter,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Abstract:Objective:To investigate the reversal of effect of double copyis in vivo on the resistance of Klebsiella pneumoniae.Methods:SD rat model with pulmonary infection induced by Klebsiella pneumordae(Kp) was set up. Then, rats were divided into four groups randomly which were PBS cintrol group, shuanghuanglian group，ceftaxime group and the combined group.The clinical manifestations of the rats in each group were observed 3 days after treatment; the number of viable bacteria in the lung of the rats and the drug sensitivity of these alive bacteria were determined. Results:The clinical manifestations and pathological sections showed that the rat modal of the drug resistant Klebsiella pneumoniae was set up successfully. The results of treatment in each group showed that the rats in the combined treatment group were cured, and the number of viable bacteria in lung and MIC of alive bacteria was significantly decreased compared with the control group (P<0.01). Conclusion: Chinese medicine Shuanghuanglian can reduce the drug resistance of Klebsiella pneumoniae in rats.

Key words:shuanghuanglian;resistant Klebsiella pneumoniae;reverse

中圖分類號：R965

文獻標志碼：A

文章編號：1001-5779(2016)02-0190-03

DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2016.02.007

(收稿日期：2015-06-10)(責任編輯：劉仰斌)