王鳳杰　王科坤　陳顯兵　劉錦紅　劉　昕

(湖北民族學院科技學院，恩施445000)

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宮頸癌組織中硒結合蛋白1表達與腫瘤微環(huán)境中抗氧化酶活性有關①

王鳳杰王科坤②陳顯兵③劉錦紅④劉昕④

(湖北民族學院科技學院，恩施445000)

[摘要]目的：探討宮頸癌患者血清和組織中谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx)活性和宮頸組織中硒結合蛋白1(Selenium Binding Protein 1，SBP1，SELENBP1)表達之間的相互關系，為SELENBP1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供理論基礎。方法：收集臨床住院病人血清樣本檢測GPx活性，收集相應宮頸組織樣本檢測GPx活性及采用Western blot方法檢測組織內SELENBP1蛋白表達水平，用Spearman等級相關來分析其相關性。結果：宮頸癌病人血清中GPx活性明顯降低；與正常宮頸、CINⅢ級組織和相應癌旁組織相比，癌組織中GPx活性增強，SELENBP1蛋白表達也降低。結論：宮頸癌組織中SELENBP1表達水平與腫瘤組織微環(huán)境中GPx活性呈負相關，而與病人血清中GPx活性無關，提示SELENBP1可能是通過腫瘤微環(huán)境中GPx來發(fā)揮抗腫瘤作用。

[關鍵詞]宮頸癌；硒結合蛋白1；谷胱甘肽過氧化物酶

近年來宮頸癌發(fā)病在我國有明顯增高趨勢，并趨于年輕化[1]，眾多研究表明人體內必需微量元素的變化，影響著自由基形成和抗氧化劑的平衡狀況，一旦失衡會損傷細胞導致疾病甚至引發(fā)惡性腫瘤[2,3]。人體內有兩大類含必需微量元素硒的含硒蛋白(Selenoprotein)，其中研究最多、最普通的是以硒代半胱氨酸(Selenocysteine,Sec)形式廣泛存在的谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)家族成員，其水平對體內硒有效性很敏感。另一類不含硒代半胱氨酸的是硒結合蛋白1(SELENBP1)，這兩類含硒蛋白是被認為與癌癥風險或發(fā)展有密切關系的[4]。硒是一種重要的、新型的、具有抗癌活性的微量營養(yǎng)元素，其抗癌作用是由SELENBP1介導的[5]，與蛋白結合才能發(fā)揮活性，通過谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)減輕過氧化氫、脂質及磷脂氫過氧化物的作用，進而抑制氧自由基和ROS的增殖[6]。但是SELENBP1的作用和具體機制還不清楚，這兩種含硒蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關系也成為研究熱點，本文主要在宮頸癌中研究這兩種含硒蛋白的關系。

1材料與方法

1.1標本收集組織標本：收集湖北民族學院民大醫(yī)院2014年5月至2015年2月婦科住院病人新鮮宮頸組織，其中子宮全切后正常宮頸(N)12例，子宮頸上皮內瘤變Ⅲ級(CINⅢ)15例，宮頸鱗癌(CA)及相應癌旁組織(pCA)標本各21例，每個組織樣本分三部分，其中一部分超純水反復清洗后制成10%組織勻漿，備用行GPx活性測定；另一部分做成直徑約0.5 cm大小組織塊，經10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水包埋，4 μm切片備用行常規(guī)染色及免疫組織化學染色(Immunohistochemical staining,IHC)觀察；剩余組織凍存于-80℃冰箱備用。所有患者術前未做過放化療、腫瘤藥物治療及微量元素補充。所有標本均有兩位以上臨床病理診斷醫(yī)師確診。

血清樣本：上述所有研究對象在空腹8～12 h后于清晨取肘靜脈血約5 ml，離心后取血清進行GPx活性測定，血清及組織中GPx活性測定方法按照試劑盒說明書操作。

1.2儀器與試劑離心機(德國eppendorf 5418 型)、721分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；BCA 法蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；SELENBP1 單抗(sc-373726)、內參β-actin(美國SANTA CRUZ 公司)；GPx活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；即用型小鼠免疫組化SABC法試劑盒及DAB顯色試劑盒(DAB-kit)(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3組織樣本檢測方法各組宮頸組織中SELENBP1蛋白的表達：取-80℃保存的各組宮頸組織加入10倍體積的pH7.4的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，用電動勻漿器制備組織勻漿，12 000 r/min、4℃離心20 min后，取上清進行蛋白定量后用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測表達情況，圖像掃描和分析采用美國UVP公司凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件。

免疫組織化學染色(IHC)：采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化(SP)法檢測，DAB顯色，一抗SELENBP1的工作濃度為1∶400，操作流程按試劑說明書進行。SELENBP1表達以細胞漿和/或細胞核出現棕黃色顆粒為陽性。

2結果

2.1血清中GPx活性測定結果三組患者血清中GPx活性測定結果見表1，可見宮頸癌患者血清中GPx活性低于正常和CINⅢ組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；正常和CINⅢ級患者血清中GPx活性無明顯差別。

2.2宮頸組織中GPx活性測定結果由表2可看出宮頸癌組織中GPx活性明顯增高(P<0.01)，癌旁組織、正常及CINⅢ級宮頸組織中酶活性無明顯差異。

2.3宮頸組織中SELENBP1定位表達情況SELENBP1表達主要位于細胞核和細胞漿，統(tǒng)計結果顯示宮頸癌組織中蛋白陽性表達率明顯降低(P<0.01)，在正常組、CINⅢ組和癌旁宮頸組織之間表達無明顯差異。見圖1。

2.4宮頸組織中SELENBP1表達情況各組宮頸組織標本中SELENBP1表達情況見表3、圖2，由統(tǒng)計分析結果可看出：宮頸癌組織中SELENBP1表達量低于癌旁組織、正常及CINⅢ級宮頸組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而在后三組標本中蛋白表達量無統(tǒng)計學差異。

2.5相關性分析Spearman相關分析結果顯示宮頸癌患者組織SELENBP1表達與組織中GPx活性呈負相關(r=-0.502，P=0.020)，而與患者血清中GPx活性無關(r=0.258，P=0.259)。癌旁組織中SELENBP1蛋白表達與GPx活性無關(r=-0.096，P=0.677)。

GroupNCINⅢCANo.121521GPx(nmol/ml)227.00±14.33215.93±15.54169.67±11.181)

Note：1)P<0.05 vs N，CINⅢ.

表2各組宮頸組織樣本中GPx活性結果

GroupNCINⅢpCACANo.12152121GPx(nmol/mg.pro)20.33±1.3719.07±1.6719.24±1.8424.29±2.761)

Note：1)P<0.01 vs N，CINⅢ，pCA.

圖1　宮頸組織中SELENBP1表達情況(IHC，×400)Fig.1　Expression of SELENBP1 in cervical tissues(IHC,×400)

表3SELENBP1在各組宮頸組織中的表達(IHC)

Tab.3Expression of SELENBP1 in cervical tissues (IHC)

GroupNo.Positive(n)Positive%N1212100CINⅢ151386.67pCA212095.24CA211361.901)

Note：1)P<0.01 vs N,CINⅢ,pCA.

圖2　各組宮頸組織中SELENBP1表達情況 (WB法)Fig.2　Expression of SELENBP1 in cervical tissues (WB)Note: *.P<0.05 vs N,CINⅢ,pCA.

3討論

SELENBP1是一種細胞溶質蛋白，是人體內硒元素的蛋白結合物，共價結合硒而介導細胞內硒的轉運，位于染色體1q21-22，是由1721個核苷酸組成編碼640個氨基酸，分子量為56 kD。宮頸癌時癌細胞會因各種原因產生大量活性氧(ROS)以逃避凋亡，也可引起癌細胞增殖、浸潤、遷移及血管生成，但ROS過高也可致凋亡，因此ROS具有促癌和抗癌雙重性[7，8]，與此同時需要體內強大的抗氧化功能來維持自身的氧化還原平衡狀態(tài)，病理情況下需要體內多種抗氧化酶來清除過多的氧自由基，以保護組織和細胞免受損傷[9]，但是我們發(fā)現宮頸癌患者血清中GPx活性低于正常對照組，也有研究發(fā)現結腸癌患者血清GPx水平也明顯降低[10,11]，可能是機體抗氧化體系在過多活性氧存在時受到破壞的結果。早期也有研究證實，與正常組織相比，腫瘤組織中清除氧自由基的抗氧化性蛋白質GPx過度表達[12]，因此腫瘤細胞才能夠避免過多ROS所致的自身損傷。我們實驗結果也表明宮頸癌組織中GPx活性明顯高于癌旁組織，可能是由于腫瘤微環(huán)境中產生了大量ROS，從而導致GPx活性增強，但宮頸癌患者血清中GPx活性是明顯降低，證明機體系統(tǒng)性抗氧化系統(tǒng)功能遭到破壞。因此這似乎有些矛盾，有學者分析認為這可能是在腫瘤發(fā)展的不同階段同一種抗氧化酶在保護癌細胞及癌前病變細胞免受氧化性損傷過程中的作用機制是不同的[8]。

目前已知宮頸癌發(fā)病與HPV感染密切相關，而HPV感染的結局與機體免疫狀態(tài)有很大關系，前期研究證實宮頸癌患者外周血中T細胞數量及CD4+T/CD8+T值顯著低于正常，但在正常組和CINⅢ組之間無明顯統(tǒng)計學差異，因此說明宮頸癌變后機體免疫功能明顯下降[13]。HPV基因的表達不僅有利于病毒隨著宿主上皮細胞分化復制，而且參加了逃避宿主免疫監(jiān)視的機制，干擾機體免疫反應的途徑，使機體檢測不到病毒的存在，從而可能使微小病變得以逐步積累，經過多年發(fā)展成宮頸癌[14]，因此對早期宮頸病變的患者適當補硒有可能提高機體免疫系統(tǒng)清除HPV的能力，并抑制癌細胞的增殖，使宮頸病變患者的預后得以改善[15]，關于HPV感染與硒結合蛋白1之間的關系是我們正在研究的內容。

相關性分析顯示宮頸癌組織中SELENBP1表達與GPx活性呈現明顯負相關，而與宮頸癌患者血清中GPx活性無明顯相關性，證明癌組織中SELENBP1表達水平與腫瘤微環(huán)境中抗氧化酶的活性有關，可能是血清中GPx活性可反映機體抗氧化體系功能，而腫瘤組織樣本中代表的是硒長期蓄積暴露的結果，血清可用于檢測短期暴露，腫瘤組織比其他生物標本更能代表長時期暴露，也更能準確反映腫瘤與微量元素的關系[16,17]，我們結果也證明了這點。關于SELENBP1與GPx之間的關系，在宮頸癌中鮮見報道，但在肝細胞癌[12]、前列腺癌[18,19]等中已證實二者存在明顯負相關，可能機制是腫瘤微環(huán)境中增強的氧化應激被活化的GPx1削弱，進一步導致癌細胞存活、增殖、惡性轉化、甚至轉移[20]，也可能是GPx在細胞內的亞細胞定位分布影響了SELENBP1的水平[21]?？傊Y合蛋白1作為一種腫瘤抑制基因[4]，可用于預測多種癌癥患者的預后，且與GPx有直接相互作用(Direct physical interaction)[19,22]。

但是SELENBP1抗癌機制尚不明確，在多種上皮來源惡性腫瘤中表達均降低，且與腫瘤患者預后明顯相關，可能是參與了晚期高爾基體內蛋白質的轉運，具有抑制細胞生長增殖的作用，還可能通過人缺氧誘導因子1α(HIF1α)促進腫瘤的進展[12,23]。在硒元素攝入量增加情況下，SELENBP1轉錄增高有利于機體對癌癥的抵抗能力，可能通過抑制細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡來抑制腫瘤的形成，其在宮頸癌中低表達甚至缺失與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，是腫瘤發(fā)生的早期事件，提示SELENBP1可成為判斷宮頸癌患者臨床預后的一項指標[24]。

總之，本研究表明SELENBP1可能作為腫瘤氧化還原微環(huán)境中的一種調節(jié)劑，通過GPx來發(fā)揮抑制腫瘤作用，可作為宮頸癌患者預后的一種腫瘤標志物，檢測SELENBP1表達將有助于指導腫瘤個性化治療。當然我們研究中存在很多不足，一是涉及的樣本量少，二是SELENBP1通過何種機制來促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，與體內ROS產生之間的關系等還知之甚少，因此需要進一步體內外研究證實。

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[收稿2015-07-25修回2015-08-07]

(編輯倪鵬)

Selenium binding protein 1 expression in cervical cancer tissues associated to antioxidant enzyme activity in tumor microenvironment

WANGFeng-Jie,WANGKe-Kun,CHENXian-Bing,LIUJin-Hong,LIUXin.

ScienceandTechnologyCollegeofHubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,China

[Abstract]Objective:To investigate the correlation between the expression of Selenium Binding Protein 1(SBP1,SELENBP1) and Glutathione peroxidase (GPx) activity in cervical cancer tissues and provide theoretical basis in the development of cervical cancer for SELENBP1.Methods: The expression of SELENBP1 was detected by Western blot in normal cervical tissues,intraepithelial neoplasia (CIN)Ⅲ,cervical cancer (CA) and related adjacent cancer (pCA) tissues,and GPx activity in serum and tissues using a spectrophotometric assay according to the instructions.Results: The GPx activity in serum of patients with cervical cancer was significantly decreased;compared with normal cervix,CINⅢ and corresponding adjacent tissues groups,GPX activity was increased,and the expression of SELENBP1 was decreased in cancer tissues.Conclusion: The role of SELENBP1 in cervical cancer development and prognosis,which can play an anticancer role through GPx in tumor microenvironment.

[Key words]Cervical cancer;SELENBP1;GPx

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.024

作者簡介：王鳳杰(1981年-)，女，碩士，講師，主要從事婦科腫瘤病理研究。

中圖分類號R373.33

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0711-04

①本文為湖北省教育廳科學技術研究項目(D20131904)；湖北民族學院科技學院科研項目(KY201410)。

②恩施州疾病預防控制中心，恩施445000。

③湖北民族學院醫(yī)學院，恩施445000。

④湖北民族學院附屬民大醫(yī)院病理科，恩施445000。

通訊作者及指導教師：陳顯兵(1976年-)，男，碩士，副教授，主要從事婦科腫瘤病理方面研究。