周福榮　付志強(qiáng)　錢世鹍

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,廣州510260)

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大鼠免疫器官中CD103+CD4+/-樹(shù)突狀細(xì)胞的分布和形態(tài)學(xué)觀察

周福榮付志強(qiáng)錢世鹍

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,廣州510260)

[摘要]目的：針對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞功能差異，探討CD103+CD4+亞群在大鼠各級(jí)免疫器官中的分布與形態(tài)差異。方法：運(yùn)用雙重免疫組化及免疫熒光雙標(biāo)記法通過(guò)CD103及CD4對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞各亞群進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)光鏡、熒光倒置顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察樹(shù)突狀細(xì)胞各亞群的含量、分布和形態(tài)。結(jié)果：腸系膜淋巴結(jié)中CD103+DC約占其內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的1.7%,胸腺次之約1.2%,脾臟最少約0.98%。不同部位各亞群DC的形態(tài)也存在一定差異，胸腺及腸系膜淋巴結(jié)DC大多數(shù)為CD4-CD103+DC且形態(tài)不規(guī)則有較長(zhǎng)突起。脾臟CD4-CD103+DC核小而不規(guī)則，突起較細(xì)小。結(jié)論：大鼠各級(jí)免疫器官中各樹(shù)突狀細(xì)胞亞群存在分布及形體差異，這一差異可能與其在遷移分化過(guò)程中在各級(jí)免疫發(fā)揮不同調(diào)節(jié)功能有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]樹(shù)突狀細(xì)胞;免疫器官;免疫熒光;免疫組化

樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)是一類專職的抗原提呈細(xì)胞，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。這群細(xì)胞中有些可以誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)異體抗原產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答；有些可以誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)特異性抗原的免疫耐受。近年研究發(fā)現(xiàn)，樹(shù)突狀細(xì)胞的功能差異主要是因?yàn)樵隗w內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞存在不同亞群[1]。但要確切肯定某一表型與其功能的關(guān)系依然受到諸多困擾。首先是因?yàn)镈C在其發(fā)育成熟過(guò)程中存在遷移、表型和形態(tài)變化，其次依照機(jī)體各級(jí)免疫調(diào)節(jié)器官發(fā)揮作用不同也影響了不同DC亞群的分布，再次目前大多實(shí)驗(yàn)在體外進(jìn)行不能完全反映機(jī)體真實(shí)情況，亦可能因?qū)嶒?yàn)因素導(dǎo)致表型與形體改變[2，3]。因此，我們希望通過(guò)對(duì)大鼠生理狀態(tài)下各免疫器官中DC亞群的分布、形體特點(diǎn)的調(diào)查，為今后深入研究病理狀態(tài)下各DC亞群表型與功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Sprague-Dawley雄性大鼠20只，6～8周齡，180～200 g/只，購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境1周。實(shí)驗(yàn)前禁食6 h，腹腔注射水合氯醛過(guò)量麻醉處死大鼠，立即取胸腺、脾及腸系膜淋巴結(jié)放入10%中性福爾馬林溶液中固定備用。

1.1.2主要試劑小鼠抗大鼠CD103單克隆抗體(eBioscience)。兔抗CD4多克隆抗體(Santa Cruse公司)。Alexa Fluor 488 羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 594 羊抗小鼠 IgG(BD phar mingen)。DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)(AppliChem公司)。DouSPTM免疫組化雙染試劑盒、液體DAB酶底物顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.2方法

1.2.1雙重免疫組織化學(xué)將固定、包埋好的組織切成5 μm石蠟切片并貼于防脫玻片上，常規(guī)脫蠟，梯度酒精水化。3%H2O2室溫處理20 min?？乖迯?fù)：檸檬酸緩沖液(0.01 mmol/L，pH6.0)微波爐高火5 min，中低火15 min。用PBS沖洗后加入一抗37℃孵育30 min。沖洗后加入生物素化二抗37℃孵育30 min后加入堿性磷酸酶復(fù)合物37℃孵育45 min， BCIP/NBT顯色5 min。沖洗后加入第二種一抗37℃孵育30 min。再次加入第二種生物素化二抗37℃孵育30 min后加入過(guò)氧化物酶復(fù)合物37℃孵育30 min，DAB顯色10 min。染色后用光學(xué)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)并拍照。

1.2.2雙標(biāo)免疫熒光標(biāo)記同1.2.1方法固定、包埋、脫蠟、水化制成5 μm石蠟切片。正常山羊血清封閉液室溫封閉20 min，抗原修復(fù)方法同1.2.1。吸去血清加入一抗混合液(CD103、CD4稀釋度分別為1∶50、1∶200)濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜。沖洗后加入二抗Alexa Fluor 594 羊抗小鼠 IgG(1∶200)37℃避光孵育30 min，再次沖洗后加入二抗Alexa Fluor 488羊抗兔 IgG、(1∶200)37℃避光孵育30 min，DAPI(1 μg/ml)室溫避光孵育15 min，滴加抗熒光衰減封片劑封片。分別在熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)及進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍照。

1.2.3樹(shù)突狀細(xì)胞各亞群計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理每張切片取10個(gè)高倍視野，CD103+DC及CD4+/-DC亞群的含量=免疫組織化學(xué)(或免疫熒光)標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/該視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%。

2結(jié)果

2.1各免疫器官中樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的分布胸腺中CD103+DC約占胸腺細(xì)胞總數(shù)的1.2%，脾臟中CD103+DC約占脾臟細(xì)胞總數(shù)的0.98%，腸系膜淋巴結(jié)中CD103+DC約占腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞總數(shù)的1.7%。表1、2分別用免疫組化法和免疫熒法檢測(cè)的CD4+CD103+DC和CD4-CD103+DC在各免疫器官中占細(xì)胞總數(shù)百分比。免疫組化和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各免疫器官中樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài) 胸腺DC(Thymus DC，TDC)主要分布在胸腺皮髓交界處及髓質(zhì)。CD4+CD103+DC細(xì)胞較規(guī)則，突起小且細(xì)，核大而圓；CD4-CD103+DC細(xì)胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，有較長(zhǎng)突起(見(jiàn)圖1)。脾臟DC(Spleen DC，SDC)分布較分散無(wú)明顯集聚區(qū)，白髓和紅髓內(nèi)均可見(jiàn)散在DC，CD4+CD103+DC異源性大，細(xì)胞大而不規(guī)則，核相對(duì)較小，突起較細(xì)??；CD4+CD103+DC中等大小，核漿比高，核規(guī)則(見(jiàn)圖2)。腸系膜淋巴結(jié)(Mesenteric lymph nodes，MLN)內(nèi)DC主要分布于副皮質(zhì)區(qū)和淋巴濾泡內(nèi)，樹(shù)突狀細(xì)胞兩亞群CD4+CD103+DC核小而不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)較多，突起細(xì)小。CD4-CD103+DC核大而圓，胞漿少，突起較長(zhǎng)(見(jiàn)圖3)。

CD103+CD4+DC1)CD103+CD4+DC(%)2)CD103+CD4-DC1)CD103+CD4-DC(%)2)T5.00±1.500.32±0.088.00±2.300.75±0.07S7.00±1.600.43±0.047.00±1.800.41±0.06MLN3.00±1.000.24±0.0827.00±5.401.59±0.06

Note：T.The thymus；S.The spleen；MLN.Mesenteric lymph nodes；1)show the number of DC subsets in tissue sections at per high power lens;2)show the percentage of DC subsets in tissue sections at per high power lens.

CD103+CD4+DC1)CD103+CD4+DC(%)2)CD103+CD4-DC1)CD103+CD4-DC(%)2)T5.00±1.400.33±0.0613.00±3.100.87±0.06S7.00±1.900.35±0.087.00±2.000.38±0.02MLN3.00±1.300.19±0.0722.00±4.601.33±0.47

Note：T.The thymus;S.Spleen；MLN.Mesenteric lymph nodes;1)show the number of DC subsets in tissue sections at per high power lens;2)show the percentage of DC subsets in tissue sections at per high power lens.

圖1　大鼠胸腺CD103+CD4+/-樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)的免疫組化和免疫熒光分析Fig.1　Detecting morphology of CD103+CD4+/-dendritic cells in rat thymus by immunohistochemistry and fluroresence immunohistochemistryNote: A.Thymus immunohistochemistry photos(×400):brown arrow for CD103+,blue arrow for CD4+;B.Thymus immunofluorescence images(×400):the green for CD103+ ,the bright red for CD4+，yellow arrow for CD103+ and CD4+ ;C.Thymus laser confocal images(×630):red arrow for CD103+ CD4-DC,yellow arrow for CD103+ CD4+ DC.

圖2　大鼠脾臟CD103+CD4+/-樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)的免疫組化和免疫熒光分析Fig.2　Detecting morphology of CD103+CD4+/-dendritic cells in rat spleen by immunohistochemistry and fluroresence immunohistochemistryNote: A.Spleen immunohistochemistry photos (×400):brown arrow for CD103+,blue arrow for CD4+;B.Spleen immunofluorescence images(×400):the green arrow for CD103+ ,the bright red arrow for CD4+，yellow arrow for CD103+ and CD4+ ;C.Spleen laser confocal images(×630):red arrow for CD103+ CD4-DC,yellow arrow for CD103+ CD4+ DC.

圖3　大鼠腸系膜淋巴結(jié)CD103+CD4+/-樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)的免疫組化和免疫熒光分析Fig.3　Detecting morphology of CD103+CD4+/-dendritic cells in rat MLNs by immunohistochemistry and fluroresence immunohistochemistryNote: A.Thymus immunohistochemistry photos (×400):brown arrow for CD103+,blue arrow for CD4+;B.Thymus immunofluorescence images(×400):the green for CD103+ ,the bright red for CD4+，yellow arrow for CD103+ and CD4+ ;C.Thymus laser confocal images(×630):red arrow for CD103+ CD4-DC,yellow arrow for CD103+ CD4+ DC.

3討論

樹(shù)突狀細(xì)胞是一個(gè)異質(zhì)性群體，大量的研究表明這種異質(zhì)性主要與其在體內(nèi)存在不同的亞群有關(guān)。在對(duì)大鼠樹(shù)突狀細(xì)胞的研究中，CD103是公認(rèn)的標(biāo)記大鼠DC的標(biāo)記方法[1,2]。在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD103+DC根據(jù)是否表達(dá)CD4表面抗原可以分成兩個(gè)功能和形體各異的兩種DC亞群[4-6]。在本次實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)CD103、CD4對(duì)胸腺、脾及腸系膜淋巴結(jié)組織切片中DC進(jìn)行標(biāo)記，對(duì)體內(nèi)生理狀態(tài)下的DC兩亞群的分布及形體學(xué)進(jìn)行直接觀察。本實(shí)驗(yàn)避免了體外實(shí)驗(yàn)對(duì)DC亞群分布及形體的干擾，使結(jié)果更接近DC在體內(nèi)的真實(shí)情況。

該實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)免疫組化免疫熒光標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)數(shù)分析我們發(fā)現(xiàn)不同免疫器官中CD103+DC的分布不均,腸系膜淋巴結(jié)中含量最為豐富約占其內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的1.7%,胸腺次之約1.2%,脾臟最少約0.98%且腸系膜淋巴結(jié)DC和胸腺DC均以CD4-CD103+DC為主分布，分別占細(xì)胞總數(shù)的1.33%和0.86%，這種差異可能與其在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中行使的功能有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)胸腺作為免疫調(diào)節(jié)的中樞器官在中樞耐受中發(fā)揮著主要作用，并且腸系膜淋巴結(jié)在口服耐受和自身耐受中發(fā)揮著主要作用[7]。這可能導(dǎo)致這些器官中某種調(diào)節(jié)免疫耐受的DC亞群含量相對(duì)占優(yōu)勢(shì)，我們認(rèn)為這種存在于胸腺和腸系膜淋巴結(jié)中的DC亞群可能是CD103+CD4-DC。而對(duì)于脾臟來(lái)說(shuō)，其主要參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，因此表現(xiàn)出CD4-DC的含量相對(duì)較少。另外，這種差異還可能與其起源有關(guān)在對(duì)小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),胸腺中約50%的DC是由外周DC遷移而來(lái)的,這些DC包括CD11b+CD8-cDCs[8]。在大鼠中與CD11b+CD8-cDCs功能相近的DC亞群為CD4+CD103+DCs,可能在大鼠中的CD4+CD103+DCs也是遷移性的DC,導(dǎo)致其在胸腺中含量較少，本實(shí)驗(yàn)所得的CD4+CD103+MLN DC及CD4-CD103+MLN DC的相對(duì)含量分別為0.19%±0.07%和1.33%±0.47%;與Turnbull等[9]通過(guò)免疫磁珠對(duì)腸系膜淋巴結(jié)各DC亞群分選結(jié)果CD4+CD103+DC在腸系膜淋巴結(jié)中很少,大多數(shù)為CD4-CD103+DC的描述相近,但他們并未給出確切的數(shù)據(jù)Cecile Voisine等[5]將新提取的脾臟經(jīng)過(guò)做成細(xì)胞懸液并運(yùn)用免疫磁珠篩選發(fā)現(xiàn)脾臟中CD103+DC的CD4+/-兩亞群所含比例相近,我們?cè)趯?duì)脾臟中DC亞群的含量研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD103+DC約占脾臟內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的0.35%，CD4-CD103+DC含量約為0.38%,結(jié)果相似。此外，不同免疫器官中DC的形態(tài)也不盡相同。胸腺CD4+CD103+DC及脾臟CD4+CD103+DC細(xì)胞較規(guī)則，核漿比高，核規(guī)則，但脾臟DC形態(tài)較小；腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD103+DC核小而不規(guī)則，核漿比小，有細(xì)小的樹(shù)突。胸腺及腸系膜淋巴結(jié)CD4-CD103+DC細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，核漿比大，均有較長(zhǎng)突起；而脾CD4-CD103+DC核漿比相對(duì)較小，突起較細(xì)小。我們認(rèn)為這種形態(tài)學(xué)上的差異可能是因?yàn)樾叵俸湍c系膜淋巴結(jié)由于要對(duì)各種不同的抗原保持一定強(qiáng)度的耐受處于相對(duì)較為活躍的狀態(tài)，所以樹(shù)突較粗且長(zhǎng);而對(duì)于脾臟主要是在機(jī)體受到病原微生物入侵等情況時(shí)功能才會(huì)活躍起來(lái)，在穩(wěn)態(tài)下，這一產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的功能并未表現(xiàn)出來(lái)，以致于其內(nèi)的樹(shù)突狀細(xì)胞也表現(xiàn)為一種未激活的狀態(tài)，細(xì)胞顯得小而樹(shù)突少。

本次實(shí)驗(yàn)研究對(duì)CD4+/-CD103+DC在大鼠各級(jí)免疫調(diào)節(jié)器官中的分布情況有了較為全面的了解，這在以前的研究中是未有的，本研究的結(jié)果將有助于我們?cè)诓±頎顟B(tài)下進(jìn)一步探究各級(jí)免疫器官如何調(diào)整CD4+/-CD103+DC亞群進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。

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[收稿2015-08-07修回2015-08-28]

(編輯張曉舟)

Observation of distribution and morphology of rat CD103+CD4+/-dendritic cells in immune organs

ZHOUFu-Rong,FUZhi-Qiang,QIANShi-Kun.

TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510260，China

[Abstract]Objective:For the functional differences in dendritic cell subsets,the study gains insight into the distributional and morphological differences of rat dendritic cells in immune organs.Methods: Immunohistochemical staining and Immunofluorescent staining were perfomed to study the morphology and the distribution of rat dendritic cells by DC marker(including CD103 and CD4).Results: In Mesenteric lymph nodes CD103+ DC accounted for about 1.7% of its total number of mononuclear cells,followed by about 1.2% in the thymus and least in spleen about 0.98%.There were certain differences among DC in different immune organs.The majority of TDCs were CD4-CD103+DC,the morphology of CD4-CD103+T DCs and MLN DCs was irregular and long dendrites could be observed .In MLN most of CD4-CD103+DCs contain a large,round nucleus and with relatively long dendrites.The nuclei of CD4-CD103+DCs were small and irregular while their dendrites was smaller.Conclusion: That the distribution and morphology of the subsets of dendritic cells in different immune organs being not identical may be related to the subsets of dendritic cells playing different regulatory functions in the process of migration and differentiation in immune organs.

[Key words]Dendritic cell；Immune organ；Immunofluorescence；Immunohistochemistry

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.012

作者簡(jiǎn)介：周福榮(1987年-),男,在讀碩士,主要從事肝癌外科及腫瘤生物學(xué)治療研究，E-mail：1010047185@qq.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：錢世鹍(1964-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事肝癌外科及腫瘤生物學(xué)治療研究，E-mail：qiansk@qq.com。

中圖分類號(hào)R392.12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)05-0656-04