楊雪峰，鄧冬雪，張　桃，寧偉偉，鄭興斌，謝　銘

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州遵義 563003)

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龍葵堿聯(lián)合VEGF抗體對(duì)人結(jié)腸癌雞胚移植模型血管生成的影響*

楊雪峰，鄧冬雪，張?zhí)?，寧偉偉，鄭興斌，謝銘△

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州遵義 563003)

[摘要]目的建立人結(jié)腸癌雞胚移植模型，探討龍葵堿、VEGF抗體及兩者聯(lián)合對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤血管生成及腫瘤增殖的影響。方法將人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞雞胚移植模型分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入龍葵堿、VEGF抗體和龍葵堿+VEGF抗體混合液，對(duì)照組加入磷酸鹽緩沖液(PBS)液。通過(guò)立體顯微鏡照相、IPP 6.0圖像分析軟件分析圖片；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CD34抗原和ki-67抗原，觀察龍葵堿、VEGF抗體和龍葵堿聯(lián)合VEGF抗體對(duì)腫瘤血管生成及腫瘤增殖的影響。結(jié)果腫瘤血管面積、CD34抗原和ki-67抗原表達(dá)：龍葵堿+VEGF抗體組明顯優(yōu)于單藥VEGF抗體組和龍葵堿組，VEGF抗體組優(yōu)于龍葵堿組，3組均明顯優(yōu)于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論龍葵堿、VEGF抗體及兩者聯(lián)合時(shí)均能抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞系誘導(dǎo)的腫瘤血管生成及腫瘤增殖，為抗腫瘤血管生成提供了一種新途徑。

[關(guān)鍵詞]龍葵堿；人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞；VEGF抗體；腫瘤血管生成；CAM

結(jié)直腸癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移與腫瘤血管生成密切相關(guān)。尋找高效、低毒的血管生成抑制劑是抗腫瘤血管生成的熱點(diǎn)之一。作為傳統(tǒng)中草藥龍葵，其提取物龍葵堿，在抗腫瘤作用方面已取得較好的研究成果[1]；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管形成最為關(guān)鍵的刺激因子，其抗體已證實(shí)具有抑制血管生成的作用[2]。為探究龍葵堿、VEGF抗體及兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人結(jié)腸癌腫瘤血管生成及腫瘤增殖影響效果，本研究應(yīng)用雞胚絨毛尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane，CAM)模型，研究龍葵堿與VEGF抗體對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞系誘導(dǎo)的腫瘤血管生成及移植瘤的影響。

1材料與方法

1.1材料人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞株遵義醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)驗(yàn)試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、南美胎牛血清、胰蛋白酶均為Hyclone公司產(chǎn)品。龍葵堿(純度95%)購(gòu)自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；兔抗人VEGF多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物有限公司。受精雞蛋購(gòu)自廣東南雄養(yǎng)雞場(chǎng)，每個(gè)平均55～60 g，孵化機(jī)購(gòu)自德州德興孵化設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%滅活胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2雞胚孵育將受精雞蛋在高錳酸鉀液中消毒后，氣室向上置于溫度為38.2 ℃、濕度60%的孵化器孵育，每天翻蛋1次。選取9 d后孵育成功的雞胚，作為實(shí)驗(yàn)備用。

1.2.3試劑配制龍葵堿液的配制:將純度95%的龍葵堿5 mg溶于1 mL 二甲基亞砜(DMSO)液中，用pH7.4、0.01 M磷酸鹽緩沖液(PBS)999 mL調(diào)整含龍葵堿的DMSO，使DMSO液在0.1%以下，抽取100 mL含龍葵堿的PBS液溶于2 mL的PBS液，配置成劑量為250 μg/mL的龍葵堿，無(wú)菌保存?zhèn)溆?。VEGF抗體液的配制:將1 mg VEGF抗體溶于1 mL PBS液中，取100 μL溶于900 μL PBS液，配制成100 μg/mL VEGF抗體液，無(wú)菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4明膠海綿制備將明膠海綿剪成大小約0.5 mm×0.5 mm，無(wú)菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5人結(jié)腸癌雞胚移植模型的建立(1)CAM制備，參照1993年付生法的方法并加以改進(jìn)，在照蛋器下，選取孵育至9 d生長(zhǎng)較好的雞胚，距胎頭下方0.5～1.0 cm處劃定開(kāi)窗位置，其大小約1.0 cm×1.0 cm，予75%乙醇消毒后置于超凈臺(tái)中，改進(jìn)方面用無(wú)菌鋸片在雞胚上沿劃定的開(kāi)窗大小輕輕劃開(kāi)，用無(wú)菌眼科鑷沿開(kāi)口打開(kāi)蛋殼，用5 mL的無(wú)菌注射器刺破卵殼膜，并加無(wú)菌生理鹽水1滴使卵殼膜與CAM分離，制造人工氣室去除卵殼膜暴露CAM。(2)HT-29細(xì)胞接種，取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，消化、離心(1 000 r/min，5 min，15～18 ℃)，用PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×106，以制作好的明膠海綿為載體，取20 μL HT-29細(xì)胞懸液接種于雞胚CAM相對(duì)無(wú)血管區(qū)域。用無(wú)菌封口膜封口，置于孵化機(jī)繼續(xù)孵育。

1.2.6給予不同類(lèi)型試劑將接種HT-29細(xì)胞的雞胚于繼續(xù)孵育后的第2天，分為實(shí)驗(yàn)組3組(龍葵堿組、VEGF抗體組、龍葵堿+VEGF抗體組，n=10)和對(duì)照組(n=10)，去除封口膜后分別加入劑量為250 μg/mL的龍葵堿，100 μL/mL的VEGF抗體各20 μL，以及250 μg/mL的龍葵堿+100 μL/mL的VEGF抗體各10 μL；對(duì)照組給予等量的PBS。封口膜封口后繼續(xù)孵育5 d，每天觀察雞胚的生長(zhǎng)情況及血管特性。

1.2.7固定取膜給藥第5天后，用4%的甲醛溶液原位固定移植瘤15～20 min，以接種區(qū)為中心用眼科鑷剪下CAM，平鋪于平皿中立體顯微鏡拍照，收集CAM上移植瘤血管圖片，用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件處理圖像，收集數(shù)據(jù)；取下的移植瘤常規(guī)石蠟包埋、切片，采用Envision二步法，檢測(cè)移植瘤CD34抗原標(biāo)記的腫瘤微血管密度(MVD)和ki-67抗原表達(dá)指數(shù)反應(yīng)腫瘤增殖。

2結(jié)果

2.1HT-29細(xì)胞移植后腫瘤新生血管的生成對(duì)照組中，接種HT-29細(xì)胞24 h內(nèi)，細(xì)胞呈淡白色黏附于CAM接種區(qū)，除CAM上原有的正常血管外，未見(jiàn)明顯的血管變化；2 d后接種區(qū)域的癌細(xì)胞開(kāi)始聚集，并可見(jiàn)少量微細(xì)的血管向瘤體集中。3～5 d后大量的新生血管向腫瘤組織接近，呈放射狀，排列紊亂，部分血管長(zhǎng)入或跨越瘤體表面，移植瘤迅速生長(zhǎng)，直徑可達(dá)5 mm，瘤體也由最初的蒼白色變成深褐色，部分瘤體表面有白色小點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1　HT-29細(xì)胞移植后腫瘤新生血管的生成

2.2龍葵堿、VEGF抗體和龍葵堿聯(lián)合VEGF抗體對(duì)腫瘤新生血管面積的影響在實(shí)驗(yàn)組中，應(yīng)用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件定量處理圖片和收集數(shù)據(jù)后，得出龍葵堿組(8.92±0.79)、VEGF抗體組(5.07±0.30)及龍葵堿+VEGF抗體組(3.40±0.20)與對(duì)照組(22.91±1.45)比較，腫瘤血管新生面積均減少，VEGF抗體組優(yōu)于龍葵堿組，龍葵堿+VEGF抗體組明顯優(yōu)于龍葵堿組和VEGF抗體組，上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

A：對(duì)照組；B:龍葵堿組；C:VEGF抗體組；D:龍葵堿+VEGF抗體組。

圖2不同類(lèi)型試劑血管新生面積

A：對(duì)照組；B:龍葵堿組；C:VEGF抗體組；D:龍葵堿+VEGF抗體組。

圖3不同類(lèi)型試劑CD34的表達(dá)(Envision ×100)

2.3龍葵堿、VEGF抗體和龍葵堿聯(lián)合VEGF抗體對(duì)MVD的影響免疫組織化學(xué)顯示CD34標(biāo)記MVD：龍葵堿組(16.4±3.51)、VEGF抗體組(14.9±2.54)和龍葵堿+VEGF抗體組(12.6±2.39)與對(duì)照組(37.83±4.03)比較，MVD值均降低，VEGF抗體組優(yōu)于龍葵堿組，龍葵堿+VEGF抗體組明顯優(yōu)于龍葵堿組和VEGF抗體組(P<0.01)，與血管新生面積的結(jié)果相一致，見(jiàn)圖3。

2.4龍葵堿、VEGF抗體和龍葵堿+VEGF抗體對(duì)ki-67抗原的影響ki-67抗原表達(dá)反應(yīng)腫瘤增殖程度：龍葵堿組(24.74±2.31)、VEGF抗體組(22.07±1.77)、龍葵堿聯(lián)合VEGF抗體組(17.15±1.06)與對(duì)照組(58.75±4.29)比較，ki-67抗原表達(dá)指數(shù)均降低，VEGF抗體組優(yōu)于龍葵堿組，龍葵堿+VEGF抗體組優(yōu)于龍葵堿組和VEGF抗體組，上述組間存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

A：對(duì)照組；B:龍葵堿組；C:VEGF抗體組；D:龍葵堿+VEGF抗體組。

圖4不同類(lèi)型試劑ki-67的表達(dá)(Envision ×100)

3討論

CAM已成為經(jīng)典的研究血管及抗血管形成的理想體內(nèi)模型。王捷等[3]應(yīng)用CAM作為載體，研究人乳腺癌細(xì)胞血管侵襲機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立CAM，動(dòng)態(tài)觀察人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29誘導(dǎo)的腫瘤血管生成及移植瘤生長(zhǎng)特點(diǎn)，與于文靜等[4]建立的人大腸癌雞胚移植模型及誘導(dǎo)的血管生長(zhǎng)特性相似。同時(shí)，運(yùn)用建立的CAM，研究龍葵堿、VEGF抗體及兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)腫瘤血管及移植瘤的影響。

現(xiàn)有的研究證明，龍葵堿可通過(guò)多種途徑達(dá)到抗腫瘤作用。李志雄等[5]研究發(fā)現(xiàn)龍葵堿可誘導(dǎo)Du145及LNCaP 細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤增殖的作用；同樣，龍葵堿還可通過(guò)升高人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞微觀系統(tǒng)內(nèi)管蛋白及微管相關(guān)蛋白(MAP-2)的表達(dá)，將MCF-7細(xì)胞阻滯于S期，抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖[6-7]。張衛(wèi)東等[8]研究發(fā)現(xiàn)龍葵堿可通過(guò)減少胃癌MGC-803 荷瘤小鼠癌細(xì)胞鈣黏蛋白的表達(dá)，干擾β-Catenin /TCF復(fù)合物的形成，阻斷Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路而誘導(dǎo)期凋亡。許揚(yáng)等[9]研究顯示龍葵給藥組藥物載體下CAM組織周?chē)軘?shù)與對(duì)照組比較明顯減少，并可見(jiàn)部分大中血管結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，提示龍葵中含有抗腫瘤血管成分?；诖耍緦?shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)龍葵堿組血管新生面積及MVD明顯低于對(duì)照組，證實(shí)了龍葵堿能抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤血管生成；ki-67抗原表達(dá)降低程度，龍葵堿組優(yōu)于對(duì)照組，提示龍葵堿可抑制腫瘤細(xì)胞增殖。但這一現(xiàn)象是龍葵堿直接作用于瘤體組織，還是通過(guò)抑制腫瘤誘導(dǎo)的新生血管而抗腫瘤作用，或者同時(shí)作用于兩者的結(jié)果，還待進(jìn)一步研究。

腫瘤血管生成是指腫瘤細(xì)胞分泌因子的刺激下，腫瘤血管生成相關(guān)因子被激活或者誘導(dǎo)生成形成血管，它能加速實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)、侵襲與轉(zhuǎn)移[10]。VEGF是公認(rèn)的直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的最強(qiáng)生長(zhǎng)因子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系。李貴新等[11]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中p53基因和VEGF之間存在正相關(guān)性，在p53和VEGF同時(shí)陽(yáng)性的腫瘤中,其MVD明顯增高,且易發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此，通過(guò)下調(diào)VEGF的表達(dá)，抑制腫瘤新生血管生成，降低MVD值，可達(dá)到抗腫瘤增殖作用。VEGF抗體，作為VEGF特異性抗體，已被證實(shí)能明顯抑制腫瘤血管生成。鄭青平等[12]研究證實(shí)了VEGF抗體能使肝癌組織中VEGF表達(dá)下降，抑制腫瘤血管因子的生成。李明娥等[13]研究表明抗VEGF121抗體能夠有效降低腫瘤組織中MVD，抑制裸鼠體內(nèi)漿液性卵巢癌下移植腫瘤的血管形成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。因此，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)移植瘤周?chē)軘?shù)明顯減少，腫瘤組織生長(zhǎng)緩慢。MVD、血管新生面積及ki-67抗原表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。表明VEGF抗體能抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞系誘導(dǎo)的腫瘤血管生成，從而達(dá)到抗腫瘤目的。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，對(duì)微血管面積與MVD的影響，VEGF抗體組高于龍葵堿組；而ki-67核增殖抗原表達(dá)，VEGF抗體組高于龍葵堿組(P<0.01)。結(jié)果顯示VEGF抗腫瘤作用強(qiáng)于龍葵堿，其原因有待進(jìn)一步研究。

然而，由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，誘導(dǎo)相應(yīng)腫瘤血管生長(zhǎng)因子的生成多樣性，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的多樣性，單一腫瘤血管抑制劑與聯(lián)合用藥治療某一實(shí)體腫瘤相比較，有效性可能差[14]。龍葵堿與VEGF抗體聯(lián)合，利用兩者不同的抗腫瘤機(jī)制,一方面龍葵堿既可直接殺死腫瘤細(xì)胞，也可通過(guò)抑制腫瘤血管生成而抗腫瘤增殖，彌補(bǔ)VEGF 抗體單一通過(guò)抑制腫瘤血管形成而抗腫瘤作用；另一方面，VEGF抗體彌補(bǔ)龍葵堿的抗腫瘤作用不及VEGF抗體，起到增強(qiáng)作用。因而，龍葵堿與VEGF抗體起到了協(xié)同抑瘤作用。本實(shí)驗(yàn)初步應(yīng)用龍葵堿與VEGF抗體聯(lián)合作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞所誘導(dǎo)的腫瘤血管生成，實(shí)驗(yàn)顯示，龍葵堿聯(lián)合VEGF抗體作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤血管生成，其微血管面積、MVD及ki-67核增值抗原均明顯低于龍葵堿與VEGF抗體單體應(yīng)用(P<0.01)。

綜上所述，龍葵堿與VEGF抗體均能抑制人結(jié)腸癌誘導(dǎo)腫瘤血管生成，達(dá)到抗腫瘤增殖作用，而單藥VEGF抗體強(qiáng)于龍葵堿；但龍葵堿與VEGF抗體聯(lián)合應(yīng)用，能明顯抑制腫瘤血管生成，增加抗腫瘤效果作用，為臨床指導(dǎo)抗腫瘤血管生成的治療方面提供了一個(gè)新途徑。

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Effect of angiogenesis on Solanine and VEGF antibody in chicken embryo transplantation model of human colon cancer cells*

YangXuefeng,DengDongxue,ZhangTao,NingWeiwei,ZhengXingbin,XieMing△

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,theAffiliatedHospitalofZunyiMedicalColleague,Zunyi,Guizhou563003,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish model of the chicken embryo transplantation of human colon cancer cells,and investigate the effect of Solanine、VEGF antibody and Solanine combined with VEGF antibody on human colon cancer cells induce tumor angiogenesis and tumor proliferation.MethodsThe model of the chicken embryo transplantation of human colon cancer HT-29 cells were divided into three experimental group and control group.We added to the chick embryo chorioallantoic membrane with Solanine、VEGF antibody and Solanine+VEGF antibody mixture,PBS was added to the control group.Then we analysed picture through the stereomicroscope and IPP 6.0 image analysis software,using immunohistochemistry envision method to detect of CD34 antigen and ki-67 antigen,and observing effect of Solanine group,VEGF antibody group,Solanine+VEGF antibody group and the effect on the tumor angiogenesis and tumor proliferation.ResultsThe tumor angiogenesis,CD34 antigen and ki-67 antigen of Solanine+VEGF antibody group were significantly better than those of VEGF antibody group and Solanine group(P<0.01);VEGF antibody group had statistical significant difference with Solanine group(P<0.01);the effect of other three groups were better than that of the control group(P<0.01).ConclusionSolanine、VEGF antibody and Solanine combined with VEGF antibody could inhibit tumor angiogenesis and tumor proliferation of human colon cancer cell line HT-29 to induce.It provides a new way for anti-angiogenes.

[Key words]solanine；HT-29 human colon cancer cells；VEGF antibody；tumor angiogenesis；chick embryo chorioallantoic membrane

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.017

*基金項(xiàng)目：貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金(gzwkj2012-1-112)；遵義醫(yī)學(xué)院中青年基金(院字[2009]號(hào))。

作者簡(jiǎn)介：楊雪峰(1973-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事消化道腫瘤的研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail：2581303091@qq.com。

[中圖分類(lèi)號(hào)]R735.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)03-0342-03

(收稿日期：2015-07-29修回日期：2015-10-24)