PPARγ激動劑干預(yù)對急性胰腺炎小鼠肝損傷的影響*

馬增翼,許　剛,于文光,田克立△

(1.濟(jì)南軍區(qū)第456醫(yī)院，濟(jì)南 250031；2.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250012)

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PPARγ激動劑干預(yù)對急性胰腺炎小鼠肝損傷的影響*

馬增翼1,許剛1,于文光2,田克立2△

(1.濟(jì)南軍區(qū)第456醫(yī)院，濟(jì)南 250031；2.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250012)

[摘要]目的探討過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動劑羅格列酮對急性胰腺炎小鼠肝損傷的影響并對其機(jī)制進(jìn)行初步研究。方法72只健康雄性昆明小鼠分為3組,急性胰腺炎組(AP組)、羅格列酮預(yù)處理組(AP-ROS組)和生理鹽水組(NS組)，每組24只。分別于建模后6 h、12 h和24 h處死小鼠，全自動生化分析儀檢測血清淀粉酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平。運(yùn)用RT-PCR 方法檢測肝臟組織NF-κB和PPARγ mRNA表達(dá)，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測肝臟組織PPARγ和NF-κB p65蛋白表達(dá)。結(jié)果小鼠血清淀粉酶、ALT 和AST水平在相對應(yīng)的各時間點(diǎn)AP組比NS組明顯升高(P<0.01)，AP-ROS組較AP組明顯降低(P<0.01)。AP組肝臟組織PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)在造模后6 h和12 h均低于NS組(P<0.05)；AP-ROS組PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)在各時間點(diǎn)均明顯高于AP組和NS組(P<0.01)。AP組肝臟組織NF-κB mRNA和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平在各時間點(diǎn)與AP-ROS組和NS組相比較均升高(P<0.01)。結(jié)論NF-κB與小鼠急性胰腺炎肝損傷有明顯關(guān)系，PPARγ在肝損傷中的表達(dá)受到抑制；羅格列酮在AP早期能增強(qiáng)PPARγ表達(dá)，抑制NF-κB的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]核因子-κB；急性胰腺炎；肝損傷；雨蛙肽；過氧化物酶體增殖物激活受體γ

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是臨床上的一種常見病，近年來發(fā)病率逐漸上升[1]。AP患者的嚴(yán)重程度不一，80%的患者為輕型胰腺炎，20%的患者發(fā)展為重型急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)，病死率可高達(dá)29.8%，其中肺、肝、腎等多器官功能衰竭是導(dǎo)致死亡的主要原因，尤以肝衰竭的病死率最高，可達(dá)到83%[2-5]。研究表明核因子-κB (NF-κB)是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，能促進(jìn)促炎因子基因的表達(dá)，在炎癥反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用[6-7]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是一類依賴配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，許多研究表明PPARγ通過抑制NF-κB的活化來發(fā)揮抗炎作用[8-10]。本實(shí)驗(yàn)通過建立雨蛙肽誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎模型，觀察NF-κB和PPARγ在AP和藥物干預(yù)后肝臟中的表達(dá)情況，探討AP肝功能損傷機(jī)制及新的治療途徑。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料雨蛙肽購自美國Sigma公司，羅格列酮購自CAYMAN CHEMICAL COMPONY，Trizol 試劑盒購自Invitrogen公司，RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，鼠抗NF-κBp65和PPARγ單克隆抗體和兔抗β-actin單克隆抗體均購自Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG均購自金思特科技有限公司，PIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒均購自蓋寧生物科技(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動物模型與分組健康雄性昆明小鼠72只，體質(zhì)量(30±2)g，購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。將72只健康雄性昆明小鼠分為3組，即急性胰腺炎組(AP組)、羅格列酮預(yù)處理組(AP-ROS組)和生理鹽水組(NS組)，每組各24只。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食12 h，自由飲水。AP組小鼠腹腔注射雨蛙肽(50 μg/kg)，1 h注射1次，共注射7次。AP-ROS組在建立AP模型前30 min腹腔內(nèi)按10 mg/kg體質(zhì)量注入羅格列酮。NS組用與AP組相同容積的生理鹽水腹腔內(nèi)注射。

1.2.2血清學(xué)檢測各組動物分別在模型制備后的6、12、24 h,摘眼球取血，靜置60 min，血液凝固后，3 000 r/min離心10 min，取血清，采用TOSHIBA-40FR全自動生化分析儀測定血清淀粉酶、ALT和AST水平,結(jié)果以國際單位(U/L)表示。

1.2.3組織學(xué)檢查取血后引頸脫臼處死并解剖小鼠，沿前正中線剪開胸腹膜，收集小鼠胰腺和肝臟組織，一部分用于組織病理學(xué)檢查，另一部分迅速置入凍存管內(nèi)放入液氮凍存，用于進(jìn)行RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.4肝臟組織NF-κB和PPARγ mRNA表達(dá)測定肝臟組織總RNA按Trizol試劑盒說明書提取，紫外分光光度計測定總RNA含量及A260/A280值(A260/A280在1.8～2.0)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒(Invitrogen公司)說明書進(jìn)行，合成cDNA。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：雙蒸水 37.5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2(加之前要搖勻) 3 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL。PPARγ引物序列為：上游引物5′-CGT GAT GGA AGA CCA CTC GC-3′，下游引物5′-AAC CTG ATG GCA TTG TGA GA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約477 bp；β-actin引物序列為：上游引物5′-TGG TGG GAA TGG GTC AGA-3′，下游引物 5′-ACG GTT GGC CTT AGG GTT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長度約218 bp;NF-κB引物序列為：上游引物5′-GTG ACA AGC CTG TAG CC-3′,下游引物 3′-CCA GAT GAA ACC CTA GTA A-5′,擴(kuò)增產(chǎn)物長度約867 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,利用AlphaImager2200軟件進(jìn)行擴(kuò)增條帶灰度測定，將PPARγ、NF-κB擴(kuò)增條帶的掃描灰度值與內(nèi)參照β-actin的灰度值的比值(即ratio值)作為該基因RNA的表達(dá)指數(shù)。

1.2.5Western blot檢測PPARγ和NF-κB蛋白表達(dá)組織蛋白質(zhì)按PIPA裂解液(蓋寧生物科技有限公司)說明書提取，蛋白質(zhì)濃度測定按BCA蛋白定量試劑盒(蓋寧生物科技有限公司) 說明書操作。每個標(biāo)本取20 μg總蛋白上樣，以10%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后，恒流電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。以1∶1 000稀釋的小鼠抗PPARγ、NF-κB和兔抗β-actin單克隆抗體室溫輕搖雜交6 h,以1∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗室溫輕搖雜交2 h，用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，最后進(jìn)行凝膠圖像分析，結(jié)果以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值來表示。

2結(jié)果

2.1血清淀粉酶變化AP組和AP-ROS組在各時間點(diǎn)的血清淀粉酶水平均高于NS組(P<0.01)，其中12 h血清淀粉酶水平最高，AP-ROS組各時間點(diǎn)血清淀粉酶水平均顯著低于AP組(P<0.01)，見表1。

表1　各組血清淀粉酶水平比較±s，U/L)

2.2藥物干預(yù)對小鼠血清ALT和AST的影響與NS組相比，AP組和AP-ROS組小鼠血清ALT和AST水平在各時點(diǎn)均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。AP-ROS組與AP組相比較，血清ALT和AST水平均明顯下降(P<0.05)，見表2。

2.3藥物干預(yù)對小鼠肝臟組織PPARγ和NF-κB mRNA表達(dá)的影響AP組肝臟組織PPARγ mRNA表達(dá)水平在制模后各時點(diǎn)較NS組降低，在6 h和12 h 兩個時點(diǎn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，AP-ROS組肝臟組織PPARγ mRNA表達(dá)水平在造模后各時點(diǎn)明顯高于AP組和NS組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3、圖1。AP組肝臟組織NF-κB mRNA表達(dá)水平在各時點(diǎn)與NS組相比較均升高，其中以12 h時升高最顯著(P<0.01)；AP-ROS組肝臟組織NF-κB mRNA表達(dá)的變化趨勢與AP組相似，但各時點(diǎn)NF-κB mRNA表達(dá)量均低于同時點(diǎn)AP組，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3、圖2。

表2　藥物干預(yù)對小鼠血清ALT和AST水平的影響±s)

表3　肝臟組織PPARγ和NF-κB mRNA表達(dá)

1:AP-ROS組24 h；2:AP組24 h;3:AP-ROS組12 h；4:AP組12 h；5:AP-ROS組6 h；6:AP組6 h；7:NS組6 h。

圖1小鼠肝臟組織PPARγ mRNA 的表達(dá)

2.4藥物干預(yù)對小鼠肝臟組織PPARγ和NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響Western blot方法檢測了小鼠肝臟組織內(nèi)的PPARγ蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AP組PPARγ蛋白表達(dá)在各時點(diǎn)均較NS組低(P<0.05)；AP-ROS組肝臟組織PPARγ蛋白表達(dá)在各時點(diǎn)均比AP組和NS組高(P<0.01)，見表4、圖3。肝臟組織NF-κBp65蛋白在各時點(diǎn)檢測的表達(dá)結(jié)果均為：AP組>AP-ROS組>NS組，在各時點(diǎn)各組間均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表4、圖4。

1:AP-ROS組24 h；2:AP組24 h;3:AP-ROS組12 h；4:AP組12 h；5:AP-ROS組6 h；6:AP組6 h；7:NS組6 h。

圖2小鼠肝臟組織NF-κB mRNA的表達(dá)

表4　肝臟組織PPARγ和NF-κBp65蛋白表達(dá)

1:AP-ROS組24 h；2:AP組24 h;3:AP-ROS組12 h；4:AP組12 h；5:AP-ROS組6 h；6:AP組6 h；7:NS組6 h。

圖3小鼠肝臟組織PPARγ蛋白表達(dá)

1:AP-ROS組24 h；2:AP組24 h;3:AP-ROS組12 h；4:AP組12 h；5:AP-ROS組6 h；6:AP組6 h；7:NS組6 h。

圖4小鼠肝臟組織NF-κBp65蛋白表達(dá)

3討論

AP常伴有全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)發(fā)生,若得不到有效的控制，可并發(fā)多器官功能衰竭綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),最終危及生命。肝臟具有物質(zhì)代謝、分泌、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能且其血供豐富，因此在AP時非常容易合并肝損傷。肝臟是AP時胰外受損的主要器官之一，80%患者有肝功能損害[11]。肝臟損害程度與AP嚴(yán)重程度密切相關(guān)，且影響其病程和預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)通過建立雨蛙肽誘導(dǎo)的小鼠AP模型，觀察NF-κB和PPARγ在AP和藥物干預(yù)后肝臟中的表達(dá)情況，探討AP肝功能損傷機(jī)制及新的治療途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與NS組相比，AP組和AP-ROS組小鼠血清淀粉酶、ALT和AST水平均明顯升高，說明雨蛙肽誘導(dǎo)的小鼠AP發(fā)展過程中發(fā)生了肝功能損害;但應(yīng)用羅格列酮后小鼠血清淀粉酶、ALT和AST升高的程度明顯低于AP組，說明羅格列酮能有效地減輕AP小鼠肝損傷的程度。

NF-κB通常以同源或異源二聚體形式與其抑制蛋白IkBs非共價結(jié)合形成復(fù)合物，其中以p50/p65異源二聚體最常見，以無活性的形式存在于體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受到一定刺激后，NF-κB活化后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)和協(xié)調(diào)靶基因表達(dá)。許多研究已表明，在炎癥反應(yīng)中可觀察到NF-κB的活性增強(qiáng)，若抑制其活性則可阻止病程的進(jìn)一步發(fā)展，有助于炎癥盡早消退。Dunn等[11]通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在AP早期的胰腺提取物中，NF-κB DNA結(jié)合活性明顯增強(qiáng)，抑制NF-κB活性可阻止淀粉酶水平升高，促進(jìn)炎癥恢復(fù)。Satoh等[12]采用EMSA法檢測了牛黃膽酸鹽所致SAP小鼠腹膜和肺泡巨噬細(xì)胞中的NF-κB活化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB在造模后6 h就出現(xiàn)活化，認(rèn)為在SAP早期階段阻止NF-κB活動是防止多器官功能衰竭引起死亡的一種有效方法。為了探討NF-κB是否參與了實(shí)驗(yàn)性小鼠胰腺炎造成的肝損傷。本實(shí)驗(yàn)用雨蛙肽復(fù)制小鼠AP模型，系統(tǒng)觀測了NS組、AP組、AP-ROS組小鼠肝臟組織中NF-κB的mRNA和NF-κB p65蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：NS組肝臟組織NF-κB微弱表達(dá)；AP組肝臟組織中NF-κB表達(dá)明顯升高，以12 h升高最為顯著，說明AP時肝臟組織中NF-κB被活化；AP-ROS組小鼠肝臟NF-κB的表達(dá)則明顯低于AP組，表明ROS對AP小鼠肝臟NF-κB表達(dá)有抑制作用。近年來一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)，幾種炎癥介質(zhì)(如IL-6、IL-8、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1等)與局部和系統(tǒng)組織損害有關(guān)，NF-κB的活化能增加這些引起體內(nèi)免疫和炎癥反應(yīng)介質(zhì)的表達(dá)[13-14]。作者推測NF-κB活性在AP時肝臟中被抑制的同時，也影響其他生物活性物質(zhì)的進(jìn)一步表達(dá)，從而阻止對其他臟器組織的損害。

近年研究發(fā)現(xiàn)PPARγ除參與糖和脂肪代謝、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長和分化等過程外，還在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。Rollins等[15]通過小鼠AP模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，預(yù)先用PPARγ激動劑能減輕AP的嚴(yán)重程度且呈劑量依賴性關(guān)系，認(rèn)為PPARγ在AP早期階段的炎癥級聯(lián)中起著直接作用。Ivashchenko等[16]的研究發(fā)現(xiàn)雨蛙肽對胰腺上皮PPARγ敲除小鼠所致炎癥加重，且羅格列酮在水腫、巨噬細(xì)胞浸潤和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)方面的抗炎效應(yīng)與對照組相比顯著減弱，提示胰腺上皮PPARγ在抑制炎癥過程中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，PPARγ在AP組肝臟中表達(dá)明顯降低，用羅格列酮干預(yù)后，PPARγ表達(dá)量顯著升高，得出結(jié)論與國外研究一致。

總之，本研究結(jié)果表明，肝臟NF-κB參與并能加重AP時肝損傷過程，羅格列酮有可能通過激活PPARγ的活性、抑制NF-κB的活化起到減輕肝臟損傷程度的作用，研究結(jié)果為AP治療提供新的思路。對于肝臟損傷對AP惡化的影響及羅格列酮對NF-κB抑制的具體機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

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The effect of PPARγ agonists in acute pancreatitis with hepatic injury*

Ma Zengyi1,Xu Gang1,Yu Wenguang2,Tian Keli2△

(1.456th Hospital of Ji′nan Military Region,Jinan,Shandong 250031,China;2.School of Medicine,Shandong University,Jinan,Shandong 250012,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the peroxidase body growth activated receptor γ (PPARγ) agonist rosiglitazone on acute pancreatitis in mice with hepatic injury and to investigate the mechanism of hepatic injury.MethodsSeventy-two male Kunming mice were randomly allocated into three groups(24 cases for each group):acute pancreatitis group(AP group),rosiglitazone group(AP-ROS group),saline group(NS group).Mice were killed at 6,12 and 24 h after induction of acute pancreatitis.Serum amylase,ALT and AST activities were measured.The expressions of NF-κB and PPARγ mRNA were assessed by RT-PCR.The expressions of NF-κB and PPARγ protein were assessed by Western blot.ResultsCompared with NS group,serum amylase,ALT and AST levels at each time point significantly increased in AP group(P<0.01);serum amylase,ALT and AST levels in AP-ROS group were significantly lower than those in AP group(P<0.01).Compared with NS group,the expressions of liver PPARγ mRNA and protein in AP group were markedly lower at 6 h and 12 h(P<0.05),and the expressions of PPARγ mRNA and protein in AP-ROS group were significantly higher than those in NS group and AP group(P<0.01).The expressions of liver NF-κB mRNA and NF-κB p65 protein in AP group were significantly higher than those in NS group and AP-ROS group at all time points(P<0.01).ConclusionThere are clear relationships between NF-κB and hepatic injury in acute pancreatitis.The expressions of PPARγ in injuried hepatic decreased.Rosiglitazone can increase the expressions of PPARγ and prevent the expressions of NF-κB in hepatic during the early phase of acute pancreatitis.

[Key words]NF-κB；acute pancreatitis;hepatic injury;cerulein;peroxidase body growth activated receptor γ

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.010

* 基金項(xiàng)目：山東省科技發(fā)展計劃(2006GG2202021);山東省自然科學(xué)基金(Y2005C29)。

作者簡介：馬增翼(1979-)，主治醫(yī)師，主要從事消化內(nèi)科工作?！魍ㄓ嵶髡撸?E-mail:tiankeli@sdu.edu.cn。

[中圖分類號]R34

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)11-1473-04

(收稿日期：2015-10-26修回日期：2015-12-31)