吳　隼，黃　琰，楊　滿，字友梅，馬　棟，賀立山

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液科，河南新鄉(xiāng) 453100)

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ISCOM型白血病瘤苗對小鼠巨噬細胞作用的研究*

吳隼，黃琰，楊滿，字友梅，馬棟，賀立山

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液科，河南新鄉(xiāng) 453100)

[摘要]目的探討免疫刺激復合物(ISCOM)型白血病瘤苗對小鼠巨噬細胞的作用。方法將C57BL/6小鼠30只分為模型組、滅活的紅白血病細胞(FBL-3)瘤苗組(滅活瘤苗組)和滅活的FBL-3細胞+ISCOM瘤苗組(ISCOM瘤苗組)，小鼠注射FBL-3細胞建立白血病荷瘤小鼠模型，治療4周后，分離小鼠腹腔巨噬細胞，觀察不同組別的巨噬細胞吞噬功能、一氧化氮(NO)、白細胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、巨噬細胞殺傷活性和抗原呈遞功能。結果ISCOM瘤苗組小鼠腹腔巨噬細胞數量、巨噬細胞吞噬功能、IL-1、TNF-α、IL-2、T細胞增殖能力和NO高于模型組和滅活瘤苗組(P<0.05)，ISCOM瘤苗組巨噬細胞細胞殺傷活性顯著高于模型組(P<0.01)。結論ISCOM型瘤苗可以增加巨噬細胞的數量，增強巨噬細胞的吞噬作用及抗原呈遞能力。

[關鍵詞]白血病瘤苗；巨噬細胞；ISCOMs

目前血液惡性腫瘤多以化療為主，但近年來國內外在主動免疫治療白血病方面研究甚多,腫瘤疫苗可通過激活患者自身免疫系統(tǒng)，增強機體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴散和復發(fā)[1-2]。本研究在前期的研究中發(fā)現免疫刺激復合物(immunostimulating complex，ISCOM)型白血病瘤苗可增強荷瘤小鼠的巨噬細胞(Mφ)活性和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性，達到改善荷瘤小鼠的非特異性免疫和細胞免疫功能的作用，在此基礎上，本文旨在探討ISCOM型白血病瘤苗對小鼠巨噬細胞的作用。

1材料與方法

1.1材料(1)主要試劑：小鼠IL-1 Elisa試劑盒(華美生物工程公司)；小鼠TNF-α Elisa試劑盒(華美生物工程公司)；NO檢測試劑盒(南京建成公司)；小鼠IL-2 Elisa試劑盒(華美生物工程公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO，美國)；脂肪酶蛋白(SIGMA，美國)；卵磷脂(SIGMA，美國)；膽固醇(SIGMA，美國)；絲裂霉素C(SIGMA,美國) ；胎牛血清(GIBCO，美國)；MTT(SIGMA，美國)；皂苷(SIGMA，美國)；Mega-10(Amresco，美國)；[3H]-TdR(中科院上海原子能研究所，中國)。(2)實驗動物和細胞株：C57BL/6小鼠30只，6～8周齡，體質量18.0～22.0 g，雌雄各半，購買于新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心。紅白血病細胞(FBL-3)細胞株購買于中山大學實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1瘤苗的制備ISCOM疫苗的制備[3]：皂苷溶液中加入脂肪酶蛋白(1 mg/mL)使其濃度為0.02 mg/mL，7 ℃反應12 h，隨后加入80 μL脂類混合物溶液和5 mL皂苷溶液(1 mg/mL)，室溫下反應4 h。冰浴超聲處理，透析，濃縮，4 ℃保存?zhèn)溆?。脂類混合物溶液的配制[4]：將卵磷脂和膽固醇溶解于20%的Mega-10溶液中，調整濃度為10 mg/mL；皂苷溶液的配制：皂苷溶解于PBS溶液中，調整濃度為1 mg/mL。FBL-3細胞內加入絲裂霉素C(100 μg/mL)，于37 ℃水浴中放置30 min，滅活。滅活的FBL-3細胞制備：FBL-3細胞內加入絲裂霉素C(100 μg/mL)，于37 ℃水浴中放置30 min，PBS液洗3次，使用生理鹽水重新調整細胞濃度為1×106/mL。

1.2.2瘤苗免疫動物模型的建立所有小鼠均建立負瘤小鼠模型[5]，FBL-3培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，取0.2 mL 1×106/mL細胞注射于鼠左肋皮下于3～7 d可觸及腫瘤后[6]。將30只SPF級C57BL/6小鼠分為3組，模型組、滅活的FBL-3瘤苗組(滅活瘤苗組)和滅活的FBL-3細胞+ISCOM瘤苗組(ISCOM瘤苗組)，各組均進行荷瘤小鼠動物模型的建立，模型組采用等體積的生理鹽水進行治療，上述各組均每周治療1次，治療時在腫瘤部位注射瘤苗0.2 mL，治療維持4周。

1.2.3小鼠巨噬細胞的吞噬能力、殺傷活性、促炎因子和抗原呈遞能力測定小鼠腹腔灌注RPMI1640培養(yǎng)基收集小鼠腹腔巨噬細胞，37 ℃、5%CO2、RPMI1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。分離巨噬細胞計數考察不同組別中小鼠巨噬細胞數量的改變。吞噬能力：將醛化的雞紅細胞注入小鼠腹腔檢測腹腔巨噬細胞的吞噬能力，吞噬指數(%)=吞噬紅細胞的巨噬細胞數/巨噬細胞總數×100%[7]。促炎因子：采用一氧化氮(NO)、白細胞介素(IL)-1和腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒檢測巨噬細胞培養(yǎng)液表達水平。殺傷活性：采用MTT測量各組治療后的巨噬細胞殺傷活性?？乖蔬f能力測定：分離不同組別瘤苗免疫小鼠T細胞，將分離巨噬細胞共孵育，采用IL-2檢測試劑盒檢測培養(yǎng)液中IL-2水平和[3H]-TdR摻入法檢測T細胞增殖能力[8]。

2結果

2.1各組小鼠腹腔巨噬細胞數量比較模型組小鼠腹腔巨噬細胞為(3.82±1.24)×106，滅活瘤苗組為(4.16±1.41)×106，ISCOM瘤苗組為(7.43±2.27)×106；ISCOM瘤苗組小鼠腹腔巨噬細胞數量顯著高于模型組、滅活瘤苗組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.37、3.86，P<0.01)，見圖1。

a：P<0.01，與ISCOM瘤苗組比較。

圖1各組小鼠腹腔巨噬細胞數量比較

2.2各組小鼠巨噬細胞吞噬功能比較模型組小鼠巨噬細胞吞噬指數為(29.50±8.20)%，滅活瘤苗組巨噬細胞吞噬指數為(54.80±11.50)%，ISCOM瘤苗組巨噬細胞吞噬指數為(68.30±16.30)%，ISCOM瘤苗組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能高于模型組(t=6.72,P<0.01)和滅活瘤苗組(t=2.14,P<0.05)。

2.3各組小鼠巨噬細胞分泌IL-1、TNF-α及NO水平比較ISCOM瘤苗組小鼠IL-1高于模型組、滅活瘤苗組(t=7.36、2.45，P<0.05)，滅活瘤苗組IL-1高于模型組(t=6.04，P<0.01)；ISCOM瘤苗組TNF-α高于模型組、滅活瘤苗組(t=7.13、3.34，P<0.01)，滅活瘤苗組TNF-α高于模型組(t=3.92，P<0.01)；ISCOM瘤苗組NO高于模型組、滅活瘤苗組(t=9.76、3.71，P<0.01)，滅活瘤苗組NO高于模型組(t=6.69，P<0.01)，見表1。

2.4各組小鼠巨噬細胞殺傷活性比較模型組小鼠巨噬細胞細胞殺傷活性為(34.23±9.67)%，滅活瘤苗組為(60.32±14.07)%，ISCOM瘤苗組為(69.47±14.79)%，ISCOM瘤苗組、滅活瘤組小鼠巨噬細胞細胞殺傷活性顯著高于模型組(t=6.31、4.83，P<0.01)；滅活瘤苗組和ISCOM瘤苗組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.5各組小鼠巨噬細胞抗原提呈能力比較ISCOM瘤苗組IL-2高于模型組、滅活瘤苗組(t=2.34、2.42，P<0.05)；ISCOM瘤苗組T細胞增殖能力高于模型組、滅活瘤苗組(t=2.78、2.68，P<0.05)，見表2。

表1　各組小鼠巨噬細胞分泌IL-1、TNF-α及

a：P<0.01，與模型組比較；b：P<0.05，c：P<0.01，與滅活瘤苗組比較。

aP<0.01，與模型組比較。

圖2　各組小鼠巨噬細胞殺傷活性比較

a：P<0.05，與ISCOM瘤苗組比較。

3討論

ISCOM是一種全新的抗原提呈系統(tǒng)，具有佐劑和抗原提呈的雙重功能，ISCOM是由皂苷、膽固醇、磷脂、蛋白質抗原等構成的直徑為30～40 nm的球形籠狀顆粒[9]。ISCOM具有增強免疫和抗原遞呈的功能，且能同時刺激體液和細胞免疫[10]。用腫瘤疫苗進行主動特異性免疫治療是一種理想的免疫治療方法。腫瘤疫苗可以激發(fā)全身性細胞免疫，提高免疫細胞殺傷腫瘤的能力，并可誘發(fā)長期抗腫瘤免疫功能，防止腫瘤復發(fā)及轉移[11]。單核-巨噬細胞是體內重要的免疫細胞,廣泛分布于網狀內皮系統(tǒng)中，可通過主動吞噬、殺傷、消化病原體,清除體內衰老突變的腫瘤細胞,在抑制腫瘤細胞腹腔轉移過程中起到重要的免疫作用[12]。因此，本文中觀察了ISCOM型瘤苗對荷瘤小鼠巨噬細胞功能的影響，以探究巨噬細胞在ISCOM型瘤苗抗腫瘤作用中扮演的作用。

巨噬細胞可以分泌促炎癥因子IL-1、TNF-α和NO，IL-1可促進免疫應答、參與炎癥反應、促進傷口愈合及刺激造血功能等[13]。TNF-α參與炎癥反應、免疫應答及抗腫瘤等[14]，還能夠誘導其他細胞因子的釋放。巨噬細胞受到刺激活化時，釋放的大量NO具有細胞毒作用，可殺傷微生物(細菌、真菌、病毒)、寄生蟲和腫瘤細胞等，亦可誘發(fā)炎癥反應保護機體抵御外界不利因素的侵害[15]。本研究結果顯示，ISCOM瘤苗組小鼠腹腔體內的巨噬細胞數量顯著高于模型組和滅活瘤苗組，且巨噬細胞吞噬功能、殺傷活性、抗原提呈活性顯著增高，IL-1、TNF-α和NO表達水平亦顯著優(yōu)于模型組和滅活瘤苗組，此結果顯示ISCOM型瘤苗對荷瘤小鼠免疫后，巨噬細胞數量和活力均得到增強。巨噬細胞作為機體抗原提呈細胞和免疫效應細胞在ISCOM型瘤苗介導抗腫瘤免疫反應中起重要作用。

綜上所述，ISCOM型瘤苗可以增加巨噬細胞的數量，增強巨噬細胞的吞噬作用及抗原呈遞能力，也意味著提高了荷瘤小鼠的非特異性細胞免疫功能，如免疫監(jiān)視、抗原遞呈等，以便活化T淋巴細胞。白血病作為血液惡性腫瘤，臨床中需考慮化療后或骨髓移植后對殘留微小病灶的治療及預防復發(fā)，而ISCOM型瘤苗明顯提高荷瘤小鼠的巨噬細胞殺傷功能，為進一步激活T淋巴細胞創(chuàng)造條件。在臨床中，白血病患者治療后采用ISCOM型瘤苗，對消滅殘留微小病灶、防止復發(fā)意義重大。

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Study on effect of ISCOM leukemia vaccine on mouse macrophages﹡

WuSun,HuangYan,YangMan,ZiYoumei,MaDong,HeLishan

(DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453100,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of immunostimulatory complex(ISCOM) leukemia vaccine on macrophages of tumor-burdened mice.MethodsA total of 30 C57BL/6 mice were randomly divided into the model group,inactivated erythroleukemia cell FBL-3 vaccine group and inactivated FBL-3 cell plus ISCOM leukemia vaccine group.The FBL-3 cell leukemia tumor-burdened mice model was established by injection of FBL-3 cells.After treatment for 4 weeks,the mouse peritoneal macrophages were separated.Their phagocytosis effect,NO TNF-α and IL-1,killing activity and antigen-presenting function were investigated in various groups.ResultsThe number of mouse abdominal cavity macrophages,macrophage phagocytosis function,IL-1,TNF-α,NO,IL-2 and T cell proliferation ability in the ISCOM leukemia vaccine group were higher than those in the model group and the inactivated FBL-3 tumor vaccines group(P<0.05).The cell killing activity of macrophages in the ISCOM leukemia vaccine group was significantly higher than that in the model group(P<0.01).ConclusionThe ISCOM leukemia vaccine can increase the number of macrophages and enhance the phagocytosis and antigen-presenting ability of macrophages.

[Key words]leukemia vaccine;macrophages;ISCOMs

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.04.007

*基金項目：河南省教育廳基金資助項目(2006320039)。

作者簡介：吳隼(1968-)，副教授、副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事血液病惡性腫瘤的免疫治療研究。

[中圖分類號]R392.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)04-0451-03

(收稿日期：2015-06-18修回日期：2015-10-24)