宋　容，肖　覺，劉　佳，李光新，林一民

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提高免疫組織化學反應的抗原修復技術(shù)

宋容1，肖覺1，劉佳1，李光新1，林一民2△

[摘要]目的探討不同抗原修復方法對免疫組織化學反應結(jié)果的影響，以提高免疫組織化學染色陽性率。方法分別采用3種不同抗原修復方法作預處理后，進行Envision免疫組織化學二步法檢測10種常用抗體的免疫組織化學染色效果。結(jié)果石蠟組織切片，免疫組織化學反應的抗原修復方法預處理，采用高溫高壓抗原修復法，與微波抗原修復法及煮沸抗原修復法染色強度有明顯差異，高溫高壓抗原修復法明顯優(yōu)于微波法及煮沸法。結(jié)論預處理采用高溫高壓抗原修復法，既可提高免疫組織化學反應陽性表達率，又能提高制片質(zhì)量，可以一次性用于大量組織切片，是一種理想的免疫組織化學反應的抗原修復預處理方法。

[關鍵詞]抗原修復法；組織預處理；免疫組織化學

免疫組織化學技術(shù)已成為病理科實驗室的常規(guī)工作及科研工作中不可缺少的重要手段，廣泛應用于臨床病理診斷[1]，幫助評價腫瘤的增生程度和分期，對患者預后、治療等方面起到了指導作用。但在日常工作中病理標本都用10%中性福爾馬林液固定，經(jīng)過10%中性福爾馬林液固定的石蠟組織，會產(chǎn)生蛋白交聯(lián)反應遮蔽了組織內(nèi)某些蛋白抗原，阻礙了抗原與抗體的結(jié)合。為了打開蛋白間的交聯(lián)，使被封閉的抗原充分暴露[2]，抗原修復技術(shù)在免疫組織化學染色過程中成為一個極其重要的環(huán)節(jié)[3]。不同抗原修復方法直接影響免疫組織化學反應結(jié)果的表達，正確應用抗原修復技術(shù)在免疫組織化學反應實驗中有著重要作用，常用的抗原修復技術(shù)有高溫高壓抗原修復法、微波抗原修復法、煮沸抗原修復法3種方法[4]，作者將3種方法進行比較，探討高溫高壓抗原修復法對提高免疫組織化學反應結(jié)果的影響，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料收集本研究所病理科2013～2014年25份腫瘤組織標本(其中乳腺癌5份；胃癌5份；淋巴結(jié)5份；直腸癌5份；血管瘤5份)，用10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，3 μm厚，一式3份裱于經(jīng)防脫處理的載玻片上(高溫高壓組、微波爐組、煮沸組)。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑(1)儀器：家用美的不銹鋼電壓力鍋1個，內(nèi)徑24 cm,型號為PCA405；美的SNC家用微波爐1臺，型號為KS2163；家用美的電磁爐1臺，型號為RK2102，煮鍋1個，內(nèi)徑24 cm。(2)試劑：實驗選用Envision 2步染色法。一抗二抗、DAB試劑盒、0.01 mol/L檸檬酸緩沖溶液pH值6.0都購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L pH值7.2～7.4)，自己配制。

1.2.2組織切片處理將石蠟組織切片裱于防脫玻片上，放在65 ℃烤片箱內(nèi)過夜烤片，常規(guī)組織切片放入二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化后，用蒸餾水沖洗3次，然后放入3%H2O2(過氧化氫溶液)中浸泡10 min，滅活內(nèi)源性的過氧化物酶的活性,蒸餾水沖洗3次，PBS液洗3×3 min，進行3種抗原預處理。

表1　10種抗體采用3種抗原修復法免疫組織化學標記陽性的表達情況(n=25)

/：此項無表達。

1.2.3高溫高壓抗原修復法將組織切片脫蠟入水后，抗原修復液0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液(pH值6.0)1 000～1 500 mL倒入電壓力鍋內(nèi)，組織切片置于耐高溫塑料切片架上，輕輕放入電壓力鍋內(nèi)，組織切片必須位于液面下，蓋緊鍋壓閥，插上電源，將定時器調(diào)到6小格上，每小格30 s，當電壓力鍋噴氣后維持2 min，這時電壓力鍋的紅燈變成綠燈，關閉電源，將噴氣閥門打開，放氣完后，打開電壓力鍋的蓋子自然冷卻至室溫。用蒸餾水沖洗3次，PBS液洗3×3 min，加入1∶100稀釋的一抗，37 ℃孵育2 h，PBS液洗3×3 min，加入二抗，37 ℃孵育30 min，PBS液洗3×3 min，加入DAB顯色，蘇木素復染，脫水，樹膠封片，觀察。

1.2.4微波抗原修復法將組織切片脫蠟入水后，抗原修復液0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液(pH值6.0)100～150 mL倒入微波盒中，將組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入微波盒中，蓋緊蓋子，放入微波爐內(nèi)，先高火處理5 min，中火繼續(xù)處理10 min，使容器內(nèi)液體溫度保持在98 ℃左右。停火取出容器，冷卻至室溫。余下步驟與1.2.3相同。

1.2.5煮沸抗原修復法將組織切片脫蠟入水后，抗原修復液0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液(pH值6.0)1 000～1 500 mL倒入煮鍋中，將組織切片置于耐高溫塑料切片架上，輕輕放入煮鍋內(nèi)，組織切片必須位于液面下，沸騰后計時30 min,熄火，冷卻至室溫。余下步驟與1.2.3相同。

1.2.6免疫組織化學染色檢測步驟參照試劑盒操作說明。PBS代替一抗體作為陰性對照。每一抗體均采用相同濃度進行實驗。采用雙盲法由2位主治以上病理醫(yī)生進行評分，陽性表達判斷標準：抗原抗體結(jié)合物在細胞膜/細胞質(zhì)/細胞核出現(xiàn)均勻棕色細顆粒。免疫組織化學染色呈深棕色者定位強陽性(+++)，陽性細胞數(shù)占50%～80%；淺棕黃色定為弱陽性(+)，陽性細胞數(shù)占10%～<20%；介于二者之間的定為陽性(++)，陽性細胞數(shù)占20%～<50%；每張切片觀察10個高倍視野，數(shù)100個腫瘤細胞。結(jié)果以“染色強度/陽性細胞數(shù)比例”表示。

2結(jié)果

選取本病理科室最常用10種抗體分別進行3種抗原修復法免疫組織化學標記，其中9種抗體試劑盒操作說明推薦方法都是相同的熱修復方法，1種抗體試劑盒操作說明推薦方法是不需要熱修復，而熱修復包括高溫高壓抗原修復法、微波抗原修復法、煮沸抗原修復法3種方法。采用熱修復方法不同，實驗結(jié)果也不同。作者通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，有3種抗體(如CD34、HER_2、CEA)分別采用3種抗原修復方法預處理后，染色結(jié)果一致，均為陽性；另外4種抗體(如LCA、CD45RO、CD79a、CK)，分別采用3種抗原修復方法預處理后，染色結(jié)果不一致，高溫高壓抗原修復法比其他兩種抗原修復法染色結(jié)果強；抗原表達在細胞核的3種抗體(如ER、PR、P53)，分別采用3種抗原修復方法預處理后，染色結(jié)果不一致，高溫高壓抗原修復法比其他兩種抗原修復法染色結(jié)果更強，有3種抗體采用3種抗原修復法處理結(jié)果一致，而高溫高壓抗原修復法比其他兩種抗原修復法提高陽性表達的有7種，而且核內(nèi)表達者更加明顯。10種抗體3種抗原修復法免疫組化標記陽性的表達結(jié)果，見表1。

3討論

免疫組織化學染色過程中抗原修復是一個重要環(huán)節(jié)，不恰當?shù)目乖迯涂梢詫е录訇栃曰蚣訇幮缘慕Y(jié)果。病理標本大部分都采用10%中性福爾馬林液固定，組織固定過程中，組織中的蛋白質(zhì)分子交聯(lián)增加，抗原決定簇被封閉，在很大程度上影響免疫組織化學反應結(jié)果充分表達[5]。要提高免疫組織化學反應陽性表達率及制片質(zhì)量，就必須有一種較好的抗原修復方法。

加熱抗原修復(heat-induced-antigen retrieval,AR)技術(shù)是免疫組織化學發(fā)展史上重要里程碑[6]，3種抗原修復的原理大致相同，通過高頻電磁波或高溫高壓作用，將組織中因用交聯(lián)性固定劑甲醛處理而形成的醛鏈打開，使抗原充分暴露，達到修復的目的[7-8]。本實驗通過對比3種不同抗原修復方法預處理進行比較，發(fā)現(xiàn)使用高溫高壓抗原修復方法預處理，明顯優(yōu)于微波修復。因為高溫高壓能克服微波爐使用中出現(xiàn)的批次差異和“冷熱斑”的現(xiàn)象[9]，認為高溫高壓比其他加熱方法更均一。電壓力鍋在15 Psi全壓時，溫度可達120 ℃ 左右。這樣溫度對一些核抗原的去遮蔽作用顯示出明顯優(yōu)越。使更多的抗原得以暴露，使一些假陰性，弱陽性的標本得到陽性表達，組織陽性定位清晰，背景著色淺，非特異性著色弱，可以提高抗原抗體陽性檢測率，操作簡單，消耗時間短，陽性表達率較微波抗原修復法強；而微波法抗原修復時，因微波爐加熱范圍狹小，使組織切片接受微波的輻射不均勻而且量小，導致不同區(qū)域組織切片的處理強度也不一致，有明顯的邊緣效應，從而出現(xiàn)不同區(qū)域染色深淺不一的顯色現(xiàn)象。同時微波爐熱修復容易發(fā)生緩沖液干凅導致干片的現(xiàn)象，以及修復時間較長，組織易脫片[10]等多種弊端；而煮沸抗原修復時，抗原修復時間長，溫度不易控制，也易使切片受熱不均可導致組織的抗原活性恢復較差，從而影響免疫組化反應結(jié)果。高溫高壓抗原修復法明顯優(yōu)于微波抗原修復法與煮沸抗原修復法[11]。

從目前關于免疫組織化學反應的抗原技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn)，高溫高壓抗原修復靈敏度高，特異性強，結(jié)果穩(wěn)定，重復性好，一次可以修復大量組織切片，而且修復液可以反復使用。節(jié)約時間，提高工作效率[12]，本研究也證明了這一點。本文列舉了常用的10種抗體，是否符合免疫組織化學檢測的所有抗體，還有待今后的繼續(xù)研究證明，總之，高溫高壓抗原修復法是一種可提高免疫組織化學反應的較理想的預處理方法，值得推廣應用。

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(重慶市腫瘤研究所：1.病理科；2.檢驗科，重慶 400030)

作者簡介：宋容 (1964-)，副主任技師，大學專科，主要從事病理切片質(zhì)量管理工作?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:13677608556；E-mail:2602214857@qq.com。

doi:·經(jīng)驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.04.038

[中圖分類號]R446.8

[文獻標識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)04-0540-03

(收稿日期：2015-06-08修回日期：2015-10-21)