劉曉，羅慶峰，王振賀，蔡劍平，王化虹

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院消化科，北京 100034；2.北京醫(yī)院)

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幽門螺桿菌感染胃黏膜組織的DNA及RNA氧化損傷水平比較及致癌機(jī)制探討

劉曉1，羅慶峰2，王振賀2，蔡劍平2，王化虹1

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院消化科，北京 100034；2.北京醫(yī)院)

[摘要]目的通過(guò)檢測(cè)幽門螺桿菌(Hp)感染患者及正常對(duì)照人群胃黏膜組織DNA及RNA氧化損傷水平，探討氧化應(yīng)激因素在HP感染致癌中的作用。方法60例Hp感染及無(wú)Hp感染胃黏膜組織石蠟包埋，切片免疫組織化學(xué)法染色，研究級(jí)顯微鏡下觀察采集圖像，IPP軟件定量分析，檢測(cè)DNA及RNA氧化產(chǎn)物水平，并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果Hp感染患者與正常人胃黏膜局部RNA氧化水平標(biāo)記物8-oxoGsn的免疫組化陽(yáng)性染色OD值分別為0.117±0.015和0.073±0.012，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Hp感染患者與正常人胃黏膜局部DNA氧化水平標(biāo)記物8-oxodGsn的免疫組化陽(yáng)性染色OD值分別為0.220±0.036和0.210±0.055，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論Hp感染致人胃黏膜局部RNA氧化水平增高，可能與Hp致癌發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]胃腫瘤；幽門螺桿菌；免疫組織化學(xué)；氧化性應(yīng)激

1994年，WHO國(guó)際癌癥研究中心將幽門螺桿菌(Hp)列為一級(jí)致癌物。目前，關(guān)于Hp與胃癌相關(guān)性研究的熱點(diǎn)很多，氧化應(yīng)激因素是其中之一。氧化應(yīng)激反應(yīng)可能導(dǎo)致上皮細(xì)胞DNA損傷，上皮細(xì)胞增殖與凋亡失衡，這些都會(huì)增加胃癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。

一般認(rèn)為DNA氧化損傷可能引起遺傳信息的改變，而RNA氧化后可以快速降解。但是，相較于DNA，RNA面對(duì)氧化損傷時(shí)顯得更為脆弱，因?yàn)榇蟛糠諶NA都處于單鏈狀態(tài)，缺少氫鍵和組蛋白保護(hù)，而且RNA在細(xì)胞中的分布更接近活性氧和自由基產(chǎn)生的位置。一旦mRNA受到氧化損傷，則有可能通過(guò)堿基錯(cuò)配產(chǎn)生變異蛋白而影響細(xì)胞正常生理功能。當(dāng)8-羥基鳥(niǎo)嘌呤核苷酸摻入進(jìn)RNA時(shí)，就可能導(dǎo)致變異蛋白的產(chǎn)生，進(jìn)而影響機(jī)體正常生理功能[1-2]。

本研究中，我們就Hp感染慢性胃炎患者胃黏膜組織局部DNA及RNA氧化水平與無(wú)Hp感染的人群做對(duì)照，研究Hp感染導(dǎo)致組織局部DNA及RNA氧化水平變化并進(jìn)一步分析其臨床意義。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源北京醫(yī)院消化內(nèi)鏡室因上腹不適、消化不良等慢性胃炎癥狀行胃鏡檢查，確診慢性胃炎的60例患者，除外胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌、心腎功能不全、冠心病、糖尿病等。內(nèi)鏡下取胃竇部胃黏膜組織，制作蠟塊。以胃鏡下快速尿素酶法檢測(cè)Hp感染情況并切片后免疫組織化學(xué)法再次證實(shí)Hp感染情況，分為Hp陽(yáng)性組30例，Hp陰性組30例。所有患者均知情同意。其中，Hp陽(yáng)性組平均年齡(43.3±5.6)歲，Hp陰性組平均年齡(45.7±3.8)歲。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑鼠抗8-oxoGua 單克隆抗體(15A3)與鼠抗8-oxodG(N45.1)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,DNase-free RNaseA、RNase-free DNase I購(gòu)自日本TAKARA公司,SP9002系列二抗試劑盒(山羊來(lái)源)、抗體稀釋液、DAB顯色劑購(gòu)自北京中衫金橋,無(wú)水乙醇、二甲苯、檸檬酸、檸檬酸三鈉、NaCl、KCl、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀均購(gòu)自北京化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica RM 2235)、烤片機(jī)(中國(guó)天津天力機(jī)電有限公司)、研究級(jí)顯微鏡(日本Nikon公司)

1.2方法

1.2.1組織切片用石蠟切片機(jī)切取5 μm切片，撈片后置于烤片機(jī)中，70 ℃烤3 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2免疫組織化學(xué)

1.2.2.115A3染色處理步驟取上述切片于依次置于二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇脫蠟，每個(gè)梯度2 min，然后水化10 min。加入1 U/μL DNase I 37 ℃下處理1 h，PBS洗3次，H2O2酶阻斷劑(3% H2O2)避光處理15 min，PBS洗3次，山羊血清封閉液封閉30 min，吸棄封閉液，加入15A3抗體(1∶200)，4 ℃過(guò)夜孵育，PBS洗3次，二抗處理30 min，PBS洗3次，DAB鏡下顯色40 s，純凈水終止反應(yīng)后，75%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性快干膠封片。空白對(duì)照組用抗體稀釋液孵育過(guò)夜。

1.2.2.2N45.1 染色處理步驟脫蠟水化的步驟與15A3相同，水化10 min后，加檸檬酸抗原修復(fù)液(pH6.0)微波修復(fù)15 min，冷卻至室溫后，PBS洗3次。5 mg/mL DNase-free RNaseA 37 ℃下處理1 h，PBS洗3次，山羊血清封閉后加一抗(1∶100)4℃下過(guò)夜孵育，加二抗、顯色與封片的步驟與15A3染色相同。空白對(duì)照組用抗體稀釋液孵育過(guò)夜。

1.2.2.3結(jié)果圖像采集與相對(duì)定量在研究級(jí)顯微鏡下觀察采集圖像，用Image-Pro Plus(IPP)軟件進(jìn)行定量分析，背景校正后，計(jì)算平均吸光度(OD)，該值與染色深度成正比。為保證結(jié)果的客觀性，各個(gè)樣品經(jīng)不同的三個(gè)人獨(dú)立定量計(jì)算后獲得后，取其三者平均值作為其最終的平均吸光度。所有用于定量的圖像均在相同的亮度及曝光條件下采集獲取。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1RNA氧化水平變化15A3抗體染色結(jié)果顯示，Hp陽(yáng)性患者胃黏膜出現(xiàn)較深染色，Hp陰性正常人染色較淡，經(jīng)IPP軟件定量分析統(tǒng)計(jì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1及表1。

2.2DNA氧化水平變化N45.1抗體染色結(jié)果顯示，Hp陽(yáng)性患者與Hp陰性正常人的染色深淺程度相當(dāng)，經(jīng)IPP定量分析統(tǒng)計(jì)，Hp陽(yáng)性患者DNA的氧化水平略高于RNA，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2及表1。

表1　DNA與RNA氧化水平定量結(jié)果

3討論

Hp與胃癌相關(guān)性的研究熱點(diǎn)很多，如環(huán)境毒素，宿主因素(熱休克蛋白70的表達(dá)，環(huán)氧化酶的表達(dá)，IL-8的基因多態(tài)性等)，細(xì)菌因素(細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白CagA，空泡毒素相關(guān)蛋白A VacA等)，以及增加基因突變的氧化應(yīng)激因素等。其中，Hp感染引起氧化應(yīng)激反應(yīng)的可能來(lái)源及機(jī)制包括中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、胃黏膜細(xì)胞及Hp自身。Hp感染后激活吞噬細(xì)胞，通過(guò)進(jìn)一步激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，生成一系列活性氧自由基(ROS)。吞噬體通過(guò)產(chǎn)生這些高活性的ROS殺滅入侵的細(xì)菌。但若Hp感染的胃黏膜產(chǎn)生的ROS不足以殺滅Hp，吞噬體會(huì)生成更多的ROS，過(guò)量的ROS反而造成胃黏膜的損傷。

ROS中羥基自由基(·OH)破壞力較強(qiáng)，可對(duì)一些堿基進(jìn)行修飾，而在所有DNA堿基中，鳥(niǎo)嘌呤具有最低氧化勢(shì)，最易被·OH和單態(tài)氧氧化[3]。鳥(niǎo)嘌呤氧化態(tài)為8羥基鳥(niǎo)嘌呤(8-oxoG)，8羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-oxodGsn)是鳥(niǎo)苷酸經(jīng)氧化修飾后的產(chǎn)物，可在DNA子鏈上引起點(diǎn)突變，因此常作為DNA損傷的標(biāo)志物。8-羥基鳥(niǎo)嘌呤核苷酸摻入進(jìn)RNA時(shí)，產(chǎn)生的8羥基鳥(niǎo)苷(8-oxoGsn)可引起蛋白變異，產(chǎn)生損傷。

Hp感染引發(fā)胃癌的可能機(jī)制主要為：(1)上皮細(xì)胞DNA損傷；(2)上皮細(xì)胞增殖與凋亡失衡。Hp感染引起的氧化應(yīng)激在兩種致癌機(jī)制中都有重要作用。此外，氧化應(yīng)激在促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面也有重要作用。

在本研究中，我們檢測(cè)的Hp感染患者胃黏膜局部DNA及RNA氧化產(chǎn)物8-oxodGsn及8-oxoGsn的水平均比無(wú)Hp感染者增高，而RNA氧化產(chǎn)物8-oxoGsn水平增高與無(wú)Hp感染者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DNA氧化產(chǎn)物8-oxodGsn略微增高，與無(wú)Hp感染者相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見(jiàn)Hp感染后胃黏膜局部氧化應(yīng)激水平是明顯增高的，其中RNA氧化水平增高更顯著。

8-oxodGsn是DNA氧化損傷的標(biāo)記物，在Hp感染的胃黏膜組織、血漿中均會(huì)增高，且目前的研究證實(shí)，以8-oxodGsn為標(biāo)志物，測(cè)得DNA損傷水平與Hp感染程度及部位相關(guān)[4-5]。也有研究證實(shí)嚴(yán)重胃炎及胃癌患者組織8-oxodGsn水平增高，并與CagA陽(yáng)性相關(guān)[6]。但目前關(guān)于RNA損傷的研究較少。有學(xué)者用免疫組織化學(xué)及液相-串聯(lián)質(zhì)譜法分析研究了人胃癌及癌旁組織RNA氧化損傷水平，8-oxoGsn在癌旁組織中含量低，而在胃癌組織中含量明顯增高，提示RNA氧化損傷可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[7]。也有學(xué)者對(duì)222例腫瘤患者及134例健康志愿者行血及尿的8-oxoGsn及8-oxodGsn檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者水平明顯高于健康志愿者，提示臨床上可以此項(xiàng)標(biāo)記物作為腫瘤篩查的指標(biāo)[8]。目前，RNA氧化與疾病的關(guān)系在國(guó)內(nèi)外已有一些研究，但主要研究對(duì)象是神經(jīng)退行性病變方面疾病[9]。我們的研究發(fā)現(xiàn)人Hp感染胃黏膜組織局部RNA氧化損傷水平亦是明顯增高，考慮RNA氧化在Hp感染致癌的過(guò)程中可能會(huì)發(fā)揮作用。且就本研究而言，RNA氧化損傷水平較DNA氧化損傷水平更高，提示RNA氧化損傷在Hp感染致癌的過(guò)程中可能發(fā)揮著更大的作用。

當(dāng)然，本研究也存在一些不足，樣本量偏小，可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的判定產(chǎn)生一些影響。此外，未對(duì)根除Hp后局部黏膜氧化應(yīng)激水平變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，也缺乏治療后的判定。但對(duì)目前Hp感染與胃癌發(fā)病機(jī)制研究來(lái)說(shuō)，RNA氧化水平增高無(wú)疑開(kāi)辟了一條新的道路。

(本文圖1，2見(jiàn)插圖2-1)

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Clinical significance of DNA and RNA oxidative damage in human gastric mucosa infected with helicobacter pylori

LiuXiao*,LuoQingfeng,WangZhenhe,CaiJianping,WangHuahong

(*DepartmentofDigestion,theFirstHospitalofPekingUniversity,Beijing100034,China)Correspondingauthor:WangHuahong,Email:wwwanghuahong@163.com

[Abstract]ObjectiveBy comparing the amount of DNA and RNA oxidative damage detected in human gastric mucosa of helicobacter pylori infected individuals with that of a matched population control.To explore the effects of oxidation in Hp related gastric cancer.MethodsThe gastric mucosa of 60 patients, 30 of patients with and 30 of patients without Helicobacter pylori, were collected and examined via immunohistochemistry. DNA and RNA oxidative damage were detected and analyzed.ResultsThe level of RNA oxidation was significantly higher in patients with Hp(OD=0.117±0.015) than the controls(OD=0.073±0.012)(P<0.05). DNA oxidation was higher in the Hp group as well, but without statistical significance(P>0.05).ConclusionThe increased level of RNA oxidation in Hp infected individuals may be involved in the underlying mechanism of Hp related gastric cancer.

[Key words]Stomach neoplasms；Helicobacter pylori；Immunohistochemistry；Oxidative stress

基金項(xiàng)目：國(guó)家人力資源和社會(huì)保障部資助課題(人社廳函[2015]192號(hào))

作者簡(jiǎn)介：劉曉，主治醫(yī)師，Email:392528423@qq.com通信作者：王化虹，主任醫(yī)師，教授，Email:wwwanghuahong@163.com

中圖分類號(hào):R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.02.008

(收稿日期：2016-01-04)

·腫瘤：基礎(chǔ)與臨床·