張輝軍，王葆青，瞿介明

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肺科，上海 200032；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院呼吸科，上海 200025

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·論著·

內(nèi)毒素耐受對(duì)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2信號(hào)通路的影響

張輝軍1，王葆青1，瞿介明2

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肺科，上海 200032；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院呼吸科，上海 200025

摘要：為研究內(nèi)毒素耐受對(duì)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2，NOD2)信號(hào)通路的影響，將小鼠單核-巨噬細(xì)胞RAW264.7分為兩組，分別給予小劑量脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(100 ng/mL)或磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)預(yù)處理20 h，建立內(nèi)毒素耐受組和對(duì)照組。每組細(xì)胞分別給予大劑量LPS(1 000 ng/mL)或熱滅活煙曲霉孢子刺激，于刺激后0、2、6、12、24 h采用定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)細(xì)胞NOD2、受體相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2，RIP2)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)mRNA表達(dá)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素8(interleukin 8，IL-8)和TNF-α濃度。結(jié)果顯示，內(nèi)毒素耐受組無論是大劑量LPS還是熱滅活煙曲霉孢子刺激均不能增加NOD2、RIP2 和TNF-α mRNA表達(dá)及細(xì)胞上清液中IL-8、TNF-α濃度；而對(duì)照組大劑量LPS和熱滅活煙曲霉孢子刺激均可提高NOD2、RIP2 和TNF-α mRNA表達(dá)及細(xì)胞上清液中IL-8、TNF-α濃度，尤以刺激后12 h增加顯著，與刺激前(0 h)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，內(nèi)毒素耐受可能對(duì)NOD2信號(hào)通路有抑制作用。

關(guān)鍵詞：內(nèi)毒素耐受；脂多糖；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2；煙曲霉

內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁組分中的一種脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，能激發(fā)過度炎癥反應(yīng)，是臨床上全身炎癥反應(yīng)綜合征或感染性休克的常見原因[1]。內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance，ET)是指接受小劑量LPS刺激后形成的對(duì)后續(xù)大劑量LPS呈低反應(yīng)或無反應(yīng)的現(xiàn)象，其在動(dòng)物模型和人體中均得到證實(shí)[2]。然而，到目前為止內(nèi)毒素耐受機(jī)制還未完全明確[3]。

先天性免疫是機(jī)體抵御病原微生物入侵的第一道屏障。動(dòng)物的先天性免疫主要通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)來實(shí)現(xiàn)的。LPS是目前研究最多的PAMP，它是Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)的特異性配體。當(dāng)LPS與TLR4結(jié)合，TLR4被激活，繼而激活核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，引起大量促炎性細(xì)胞因子釋放。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2，NOD2)蛋白是一種胞質(zhì)內(nèi)PRR，又稱為凋亡加強(qiáng)結(jié)構(gòu)域蛋白15(caspase recruitment domain-containing protein 15，CARD15)，表達(dá)于中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、上皮細(xì)胞中，主要參與胞質(zhì)內(nèi)病原微生物的識(shí)別?，F(xiàn)已證實(shí)NOD2蛋白在抗細(xì)菌感染免疫中起重要作用。此外，本課題組以前的研究還發(fā)現(xiàn)NOD2與機(jī)體識(shí)別煙曲霉(Aspergillus，Af)的天然免疫反應(yīng)有關(guān)，熱滅活煙曲霉(heat-killed Aspergillus，HAf)孢子刺激可上調(diào)NOD2蛋白的表達(dá)，增加促炎性細(xì)胞因子的釋放[4-5]。NOD2識(shí)別的配體主要為胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)，這是一種存在于所有革蘭陰性和陽性細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)具有生物活性的肽聚糖的基本結(jié)構(gòu)。NOD2識(shí)別細(xì)菌成分后誘導(dǎo)自身寡聚化，募集受體相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2，RIP2)，并與RIP2相互作用；然后 RIP2與NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)激酶相互作用，激活NF-κB，促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[6-7]。

PRR一直是免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)，但到目前為止，關(guān)于NOD2在內(nèi)毒素耐受中的作用研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，NOD2配體可增加LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放，這種協(xié)同作用在內(nèi)毒素休克時(shí)也可觀察到[8]。Pauleau等發(fā)現(xiàn)2-/-小鼠內(nèi)毒素休克時(shí)的存活率增加[9]。此外，Kim等研究也發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子釋放需NOD2的存在[10]。這些研究均提示，NOD2信號(hào)通路與LPS誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子釋放有關(guān)，因此推測(cè)NOD2信號(hào)通路有可能參與內(nèi)毒素耐受的過程。對(duì)此進(jìn)行研究，將有助于闡明內(nèi)毒素耐受的機(jī)制，并為內(nèi)毒素耐受應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

小鼠單核-巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。煙曲霉菌株由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科真菌研究室惠贈(zèng)。實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)相關(guān)試劑有TRIzolTMReagent(Invitrogen，USA)、SuperScript Ⅱ(Invitrogen，US)、Ex Taq?Hot-Start Version 2.0 for Real-time PCR Kit(TaKaRa公司)、SYBR?Green Ⅰ熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(TaKaRa公司)。白細(xì)胞介素8(interleukin 8，IL-8)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1煙曲霉孢子的收獲將煙曲霉菌株接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4 d。在超凈工作臺(tái)內(nèi)用生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面，收集分生孢子懸液，8層紗布過濾以去除菌絲；將孢子懸液轉(zhuǎn)入離心管中，3 000 r/min離心15 min，去除上清液，孢子重懸于生理鹽水中；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)孢子數(shù)，調(diào)整孢子懸液密度為6.7×109/mL，煮沸1 h滅活；將收獲的熱滅活煙曲霉孢子懸液稀釋100倍，接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)基以檢測(cè)孢子活性。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理將RAW264.7細(xì)胞調(diào)整密度為5×105/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，4 h 后細(xì)胞完全貼壁。細(xì)胞貼壁后內(nèi)毒素耐受組加小劑量LPS，終濃度為100 ng/mL；對(duì)照組加等體積磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)。20 h后棄上清液，用相應(yīng)的無血清培養(yǎng)液洗2遍，加新鮮培養(yǎng)液，2 h后給予大劑量LPS(1 000 ng/mL)或熱滅活煙曲霉孢子(細(xì)胞/孢子比為1∶10)刺激，每組于加入大劑量LPS或熱滅活煙曲霉孢子后0、2、6、12、24 h取樣本。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)mRNA基因引物合成：通過文獻(xiàn)檢索獲得引物序列(表1)，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Primer 5.0和PubMed BLAST驗(yàn)證引物，反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)目的條帶大小符合，無明顯雜帶。

在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取樣本，用冰PBS洗3遍，每孔加0.3 mL TRIzol反復(fù)吹打，使細(xì)胞變性，收集至1.5 mL無酶Eppendorf管，-70 ℃保存。提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用定量PCR分別檢測(cè)NOD2、RIP2、TNF-α mRNA及管家基因GAPDH mRNA，每次檢測(cè)時(shí)將外參標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，取4個(gè)梯度(106、105、104、103copies/μL)作為擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品，采用iCycle定量PCR專用分析軟件根據(jù)循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各測(cè)定孔的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定對(duì)應(yīng)的log基因拷貝數(shù)(log copy number)，自動(dòng)列出最終定量結(jié)果，以其拷貝數(shù)與GAPDH的比值作為基因的最終相對(duì)表達(dá)量。

表1定量PCR引物序列

Tab.1Primers of quantitative PCR

GeneSense(5'-3')Antisense(5'-3')LengthNOD2GAAGTACATCCGCACCGAGGACACCATCCATGAGAAGACAG174bpRIP2ACGTCTGCAGCCTGGTATAGCAGGGCATCTAGCGACTGGTTAA101bpTNF-αGGTTTCGAAGTGGTGGTCTTGCCTGCCCCAATCCCTTTATT131bpGAPDHGGTATCGTGGAAGGACTCATGACATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC188bp

A:Expression of NOD2 mRNA after stimulation of LPS.B:Expression of RIP2 mRNA after stimulation of LPS.C:Expression of TNF-α mRNA after stimulation of LPS.D:Expression of NOD2 mRNA after stimulation of HAf.E:Expression of RIP2 mRNA after stimulation of HAf.F:Expression of TNF-α mRNA after stimulation of HAf.

圖1定量PCR檢測(cè)NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表達(dá)

Fig.1Expressions of NOD2,RIP2 and TNF-α mRNA detected by quantitative PCR

1.2.4ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-8和TNF-α濃度采用定量夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)統(tǒng)一檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8和TNF-α濃度，具體步驟按說明書操作。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 12.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1NOD2、RIP2和TNF-α mRNA的表達(dá)

內(nèi)毒素耐受組細(xì)胞接受大劑量LPS或熱滅活煙曲霉孢子刺激后各時(shí)間點(diǎn)(2、6、12、24 h)NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表達(dá)與刺激前(0 h)比較無顯著增加；對(duì)照組細(xì)胞接受大劑量LPS或熱滅活煙曲霉孢子刺激后各時(shí)間點(diǎn)(2、6、12、24 h)NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表達(dá)增加，尤以12 h時(shí)最顯著，與刺激前(0 h)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.2細(xì)胞上清液中IL-8和TNF-α濃度

內(nèi)毒素耐受組細(xì)胞接受大劑量LPS或熱滅活煙曲霉孢子刺激后各時(shí)間點(diǎn)(2、6、12、24 h)與刺激前(0 h)比較，細(xì)胞上清液中IL-8和TNF-α濃度無顯著增加；對(duì)照組細(xì)胞接受大劑量LPS或熱滅活煙曲霉孢子刺激后各時(shí)間點(diǎn)(2、6、12、24 h)細(xì)胞上清液中IL-8和TNF-α濃度增加，尤以12 h時(shí)最顯著，與刺激前(0 h)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

A:Concentration of IL-8 after stimulation of LPS.B:Concentration of TNF-α after stimulation of LPS.C:Concentration of IL-8 after stimulation of HAf.D:Concentration of TNF-α after stimulation of HAf.

圖2ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-8和TNF-α濃度

Fig.2Concentrations of IL-8 and TNF-α detected by ELISA

3討論

天然免疫系統(tǒng)能對(duì)危險(xiǎn)信號(hào)如細(xì)菌、腫瘤、組織損傷進(jìn)行監(jiān)測(cè)并作出反應(yīng)。監(jiān)測(cè)到危險(xiǎn)信號(hào)時(shí)，天然免疫系統(tǒng)可被激活，PRR在此過程中發(fā)揮重要作用。然而，過度炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體是有害的，機(jī)體需一些重要機(jī)制對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行精密調(diào)節(jié)，以防止發(fā)生感染性休克、自身免疫性疾病等不良后果。其中一個(gè)重要機(jī)制就是內(nèi)毒素耐受[2,11]。促炎性細(xì)胞因子TNF-α可能是評(píng)判內(nèi)毒素耐受最好的標(biāo)記。在LPS耐受體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，第一次LPS刺激后TNF-α分泌迅速升高，給予LPS再次刺激后TNF-α分泌顯著減少[12]。本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠單核-巨噬細(xì)胞RAW264.7作為細(xì)胞模型，首先給予小劑量LPS預(yù)刺激，當(dāng)再給予大劑量LPS刺激時(shí)TNF-α和IL-8釋放無明顯增加；而對(duì)照組給予大劑量LPS刺激后TNF-α和IL-8釋放顯著增加，證明內(nèi)毒素耐受細(xì)胞模型建立成功。

有研究發(fā)現(xiàn)，LPS預(yù)刺激不僅可對(duì)后續(xù)大劑量LPS刺激起保護(hù)作用，還可減少其他炎癥刺激所引起的促炎性細(xì)胞因子釋放，如革蘭陽性細(xì)菌感染[13]。而革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞壁成分MDP是NOD2的特異性配體，提示LPS預(yù)處理可能對(duì)NOD2的功能產(chǎn)生影響?，F(xiàn)已證實(shí)，NOD2信號(hào)通路不僅在細(xì)菌感染免疫中發(fā)揮重要作用，在抗煙曲霉感染免疫中也發(fā)揮重要作用，Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉刺激可增加NOD2和RIP2的表達(dá)；通過RNA干擾減少NOD2基因表達(dá)，則可減少煙曲霉誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。Wu等[14]的研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抗TLR2抗體預(yù)處理阻斷TLR2，可減少M(fèi)DP誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子釋放，提示NOD2信號(hào)通路與TLR2信號(hào)通路存在某種密切聯(lián)系。LPS是TLR4的特異性配體，雖然科學(xué)家們對(duì)TLR4信號(hào)通路和NOD2信號(hào)通路分別進(jìn)行了深入研究，但關(guān)于兩者相互聯(lián)系的研究較少。Selvanantham等研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌感染時(shí)NOD2蛋白能協(xié)同TLR4增加IL-2的產(chǎn)生并促進(jìn)恒定自然殺傷T細(xì)胞(invariant nature killer T cell，iNKT細(xì)胞)的激活[15]。在過度表達(dá)NOD2的sw620細(xì)胞中，LPS誘導(dǎo)的IL-8產(chǎn)生明顯增加[16]。這些研究結(jié)果均提示，NOD2信號(hào)通路與TLR4信號(hào)通路在機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)中密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于小劑量LPS預(yù)處理的RAW264.7細(xì)胞，無論是用大劑量LPS還是熱滅活煙曲霉孢子刺激，均未能上調(diào)NOD2、RIP2基因的表達(dá)，同時(shí)TNF-α、IL-8的分泌受到抑制；而對(duì)照組細(xì)胞大劑量LPS和熱滅活煙曲霉孢子刺激均顯著上調(diào)NOD2、RIP2基因的表達(dá)，顯著增加TNF-α、IL-8的分泌，提示LPS預(yù)處理對(duì)NOD2信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用，從而減少了促炎性細(xì)胞因子釋放。

綜上所述，內(nèi)毒素耐受可抑制NOD2信號(hào)通路，但具體機(jī)制和意義有待進(jìn)一步研究。

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Effect of endotoxin tolerance on nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 signaling pathway

ZHANG Huijun1,WANG Baoqing1,QU Jieming2

1.Department of Pulmonary Medicine,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China;2.Department of Pulmonary Medicine,Ruijin Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200025,China

Abstract:To investigate the potential effect of endotoxin tolerance on nucleotide-binding oligomerization domain containing 2(NOD2)signaling pathway,murine macrophage RAW264.7 cells were pretreated with lipopolysaccharide(LPS,100 ng/mL)or phosphate buffered saline(PBS)for 20 h to establish endotoxin tolerance group and control group respectively.Both groups were subjected to the treatment with LPS(1 000 ng/mL)or heat-killed Aspergillus(HAf).The mRNA levels of NOD2,receptor-interacting protein 2(RIP2)and tumor necrosis factor α(TNF-α)were measured at 0,2,6,12,24 h after stimulation by real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR).The concentrations of secreted TNF-α and interleukin 8(IL-8)were also quantified by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The collective results showed that neither LPS nor HAf had any significant effect on NOD2,RIP2,and TNF-α transcription or TNF-α and IL-8 secretion in the endotoxin tolerance group.On the contrary,a clear up-regulation was detected in the control group upon either LPS or HAf treatment,concomitant with a peak at 12 h after stimulation.These data indicate that the NOD2 signaling pathway might be suppressed under endotoxin tolerance conditions.

Key words:Endotoxin tolerance;Lipopolysaccharide;Nucleotide-binding oligomerization domain containing 2；Aspergillus

基金項(xiàng)目：教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)-新教師基金資助(20090071120029)

通信作者：瞿介明

Corresponding author.QU Jieming,E-mail:jmqu0906@163.com

(收稿日期：2015-11-18)