王錦秀，黎 濤，趙 平(四川省廣元市中心醫(yī)院消化內科，四川 廣元 628017)

基于木犀草素聯(lián)合阿霉素治療肝癌基礎研究

王錦秀，黎 濤，趙 平
(四川省廣元市中心醫(yī)院消化內科，四川 廣元 628017)

目的 制備載木犀草素及阿霉素雙藥膠束，評價該膠束并考察體內外治療原發(fā)性肝癌療效。方法 溶劑揮發(fā)法制備載木犀草素及阿霉素的雙藥膠束，采用馬爾文粒徑儀測粒徑，評價載雙藥膠束體外釋放情況；考察其體外抗原發(fā)性肝癌活性，并建立原發(fā)性肝癌昆明鼠皮下模型，考察該載藥膠束體內治療原發(fā)性肝癌療效。結果 載雙藥膠束平均粒徑(112.5±2.3)nm(n=3)，多分散指數(PDI)(0.152±0.014)，對兩種抗癌藥物包封率均>80%。載雙藥膠束對人肝癌細胞HepG2細胞的細胞毒性顯著大于兩種抗癌裸藥(n=5，均P< 0.05)，細胞對藥物攝取率也明顯高于裸藥。體內實驗提示載雙藥膠束能抑制腫瘤增殖，相對裸藥組，能顯著提高荷瘤小鼠存活時間(χ2=4.874，P< 0.05)。結論 載雙藥膠束粒徑小，對木犀草素及阿霉素的包封率高，相對于裸藥，載藥膠束能提高藥物細胞攝取，且能增強細胞毒性作用。該載藥膠束可以作為一種治療原發(fā)性肝癌新的載藥體系。

木犀草素；阿霉素；膠束；原發(fā)性肝癌

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLA) 是一種惡性程度高、進展快、預后差的惡性腫瘤，全世界發(fā)病率和死亡率分別列所有腫瘤的第7位和第4位[1]。原發(fā)性肝癌早期癥狀并不明顯，發(fā)現時已多處于晚期，而晚期患者多因癌細胞擴散和轉移導致化療、放療療效均較差。所以，研發(fā)新的載藥體系，提高原發(fā)性肝癌治療療效勢在必行。木犀草素是一種從天然中草藥中提取的多酚類化合物[2]，廣泛存在于金銀花、白毛夏枯草等藥物中[3]。其作用于腫瘤細胞的線粒體[4]，對多種腫瘤細胞增殖都有一定程度抑制作用，特別是對原發(fā)性肝癌有明顯抑制效果[5，6]。但由于木犀草素屬于黃酮類化合物，溶解性差，限制了其抗腫瘤療效[7]。阿霉素是臨床上常用廣譜抗腫瘤藥物，進入腫瘤細胞后嵌入DNA，抑制DNA合成，進而抑制腫瘤細胞增殖[8]。本實驗選用聚合物F127制備納米膠束包載木犀草素和阿霉素，評價該膠束并考察其體內外治療原發(fā)性肝癌療效。

1 材料與方法

1.1 材料 木犀草素購自西安昊軒生物有限公司；阿霉素購自大連美侖生物技術有限公司；制備膠束的高分子F127購自四川鉑克科技有限公司；HepG2、H22肝癌細胞株購買于中國科學院上海細胞實驗室；所有免疫組化試劑盒購自凱基生物；實驗用化學試劑購自成都科龍化工有限公司。

1.2 膠束的制備 本膠束制備采用溶劑揮發(fā)法[9]。操作如下：稱取聚合物F127、脫鹽酸化阿霉素和木犀草素溶解于四氫呋喃，注射器勻速緩慢滴加至適量中速攪拌的蒸餾水中。然后放置于通風櫥中攪拌至四氫呋喃全部揮發(fā)，透析除掉沒有包載的藥物，凍干得到載雙藥膠束。

1.3 膠束粒徑、臨界膠束濃度、包封率和載藥率測定 用馬爾文粒徑儀測得載雙藥膠束平均粒徑，臨界膠束濃度(critical micelle concentration，CMC)采用芘熒光探針法。稱取20 mg載藥凍干粉末，二甲基亞砜(DMSO)溶解后用高效液相色譜測該膠束成份。通過標準曲線得到木犀草素和阿霉素兩種藥物濃度，進而根據下列公式計算出膠束載藥量和載藥效率：

1.4 體外釋放實驗該載藥膠束釋放實驗 分別模擬了膠束在血液循環(huán)和細胞中釋放環(huán)境，透析介質為磷酸鹽緩沖液體系PBS(pH=7.4)和醋酸鹽緩沖液體系ABS(pH=5.0)。量取1 ml載雙藥膠束水溶液加入截留分子量為5000透析袋中，用棉線系好兩頭后，放入50 ml離心管。加入30 ml透析液，將離心管置于37 ℃恒溫搖床中震搖。分別于30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h及36 h取出1 ml透析液，然后再補加入1 ml新的透析液繼續(xù)在搖床上震搖。將取出的透析液用0.22 μm微孔過濾器過濾，用高效液相色譜檢測，記錄峰面積，并根據標準曲線計算得到木犀草素和阿霉素濃度。然后計算不同時間點雙藥膠束累積釋放百分率，根據結果繪制出兩種藥物在不同緩沖液體系下體外釋放曲線。

1.5 細胞毒性實驗 取對數期生長的HePG2細胞，胰酶消化后用10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋細胞，顯微鏡下觀察細胞密度為1×105個/毫升，吹打均勻后加入96孔板，置37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h。將木犀草素、阿霉素與載雙藥膠束分別以無血清培養(yǎng)基稀釋，其中木犀草素需要加入DMSO促溶，每孔加100 μl，每個濃度6個平行孔。將96孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h后每孔加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h。吸干孔內液體后，每孔加入100 μl DMSO，于搖床上振蕩10 min以溶解藍紫色結晶物。在570 nm波長下，用酶標儀測定吸光度(A)，計算細胞存活率。細胞存活率計算公式如下[10～12]：細胞存活率=A樣品/A對照×100%。A樣品為木犀草素，阿霉素以及載雙藥膠束混合培養(yǎng)細胞后所測得的吸光度值。A對照為空白培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞后測得的吸光度值。

1.6 細胞對膠束的攝取 取對數生長期HepG2細胞接種于24孔板，將裸藥阿霉素和載雙藥膠束用無血清培養(yǎng)基稀釋到10 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。孵育結束后，移液器吸去培養(yǎng)基，加入PBS終止細胞攝取，并用PBS沖洗三遍，乙醇4 ℃固定30 min，加5 μg/ml DAPI，繼續(xù)孵育10 min，PBS沖洗，最后熒光顯微鏡下觀察細胞對藥物攝取情況。繼續(xù)孵育10 min，PBS沖洗，最后熒光顯微鏡下觀察細胞對藥物攝取情況。

1.7 小鼠腫瘤模型的建立 24只體重25 g左右雌性昆明小鼠分別在左前腋皮下注射100 μl無血清培養(yǎng)液含2×106個小鼠肝癌細胞H22細胞。接種后每天觀察腫瘤生長情況，10天后小鼠左前腋皮下腫瘤可見且體積約為50 mm3(利用游標卡尺測量腫瘤的長徑a和短徑b，按照腫瘤體重公式V=ab2/2進行計算)。建模成功的昆明鼠隨機分為載雙藥膠束組、裸藥阿霉素組、裸藥木犀草素組及空白組，每組6只。

1.8 小鼠體內抗腫瘤治療 建模成功后第0、3、6、9天，通過尾靜脈注射給藥物治療，4組樣品分別為載雙藥膠束組、裸藥阿霉素組、裸藥木犀草素組和空白鹽水組。根據小鼠體重計算每組注射劑量(阿霉素3 mg/kg，木犀草素3 mg/kg)。第一次尾靜脈給藥之后每隔2天測量老鼠腫瘤體積。

1.9 組織標本的處理和檢測 藥物治療結束后第12天取出腫瘤組織，石蠟包埋切片后行HE和TUNEL染色。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0 軟件進行分析。計量資料用均數(標準差描述，計量資料用頻數和百分數描述，計量資料組間比較采用t檢驗或非參數檢驗。計數資料采用卡方檢驗。用Kaplan-Meier法估計組間的累積生存率，并用Log-rank檢驗進行比較。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膠束粒徑、臨界膠束濃度、包封率和載藥率測定及體外釋放實驗 膠束粒徑為(112.5±2.3) nm(n=3)，多分散指數(PDI)為(0.152±0.014)，表明該膠束粒徑分散均勻。該膠束CMC為0.72 mg/L(見圖1a)，其中木犀草素包封率(n=3)和載藥率(n=3)分別為(73.45±3.4)%、(5.61±0.23)%，阿霉素包封率(n=3)和載藥率(n=3)分別為(83.12±2.6)%、(6.89±00.18)%(見圖1b)。

圖1 載雙藥膠束的評價 A：粒徑分布；B：藥物釋放曲線

2.2 細胞毒性實驗 載雙藥膠束對HepG2細胞的增殖抑制作用明顯高于單用木犀草素(t=4.939，P< 0.01)以及單用阿霉素(n=5，t=2.429，P< 0.05)見圖2。

圖2 木犀草素、阿霉素以及載雙藥膠束對HepG2細胞的細胞毒性作用(n=5)

2.3 細胞對膠束的攝取 細胞核被DAPI染成了藍色熒光，A為裸藥阿霉素攝取情況，而B為載雙藥膠束攝取情況見圖3。從圖中可以看出，A的紅色熒光和B的紅色熒光無顯著差異，證明該載雙藥物膠束可以將藥物遞送到細胞內。

2.4 載雙藥膠束的體內抗腫瘤組織病理切片 從圖4中可以看出，空白組細胞形態(tài)完整，無細胞空泡，細胞形態(tài)完整，未出現凋亡現象。阿霉素組和木犀草素組則部分細胞出現空泡和細胞輪廓不完整。載雙藥膠束組則大量細胞出現空泡細胞輪廓不完整，細胞核也有大量破碎。從圖4中可以看出，載雙藥膠束組凋亡細胞最多，阿霉素組次之，木犀草素組則比阿霉素組細胞凋亡的更少，生理鹽水組幾乎沒有細胞凋亡。

圖3 阿霉素和載藥膠束細胞攝取 A：為裸藥阿霉素組，B：為載雙藥膠束組，從左到右依次是DAPI染細胞核的熒光，阿霉素熒光，合圖為阿霉素和DAPI熒光的疊加，明場為光鏡下細胞的形態(tài)圖(比例尺=100 μm)

圖4 小鼠原發(fā)性肝癌皮下腫瘤模型治療后病理切片 a：HE染色，b：Tunel染色

2.5 小鼠體內抗腫瘤效果 藥物治療結束后第21天，膠束組、裸藥阿霉素組、裸藥木犀草素組及空白組老鼠除處死做病理切片檢查外均未出現死亡，第21天的腫瘤平均體積分別為：(105.5±52.3)mm3、(475.4±73.2)mm3、(825.6±68.3)mm3及(1650±122)mm3，裸藥阿霉素和裸藥木犀草素組腫瘤平均體積均高于載雙藥膠束組(t=9.194，t=18.718，均P< 0.01)。空白組老鼠在第30天開始即出現死亡，至第38天老鼠完全死亡；裸藥阿霉素和裸藥木犀草素組則分別從第40天和第34天開始出現死亡，至飼養(yǎng)周期結束(第50天)，2組老鼠也全部死亡；而膠束組除一只非正常死亡外，其余老鼠均未死亡。生存曲線如圖5所示。采用Log Rank對各組生存曲線分布進行分析，結果表明，載雙藥膠束組相比于阿霉素組和木犀草素組，小鼠生存率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.874，χ2=4.874，均P< 0.05)。而木犀草素組和阿霉素組相比，小鼠生存率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.046，P> 0.05)。

圖5 各組小鼠生存曲線圖

3 討論

木犀草素作為一種植物中提取的抗癌藥物，其良好抗癌活性可以用于原發(fā)性肝癌治療。針對木犀草素溶解性差和口服難以起效等缺點，我們采用膠束包載木犀草素治療原發(fā)性肝癌，能解決木犀草素治療腫瘤的缺點。同時，針對木犀草素治療靶點為細胞的線粒體，本實驗包載了廣譜細胞核靶向的腫瘤化療藥物阿霉素，聯(lián)合兩種不同作用機理抗癌藥物，可以有效協(xié)同治療原發(fā)性肝癌。

目前臨床有多種治療原發(fā)性肝癌藥物，但經常發(fā)生腫瘤細胞耐藥，而本實驗設計了聯(lián)合包載阿霉素和木犀草素膠束治療原發(fā)性肝癌，則能有效避免腫瘤細胞耐藥，為原發(fā)性肝癌抗耐藥治療提供了新思路[13～15]。本實驗針對目前抗癌藥物在水中難溶解以及體內抗腫瘤活性不高的缺點，采用納米膠束包載抗癌藥物，很好的解決了藥物溶解性問題。同時，利用納米膠束的尺寸優(yōu)勢，以及腫瘤血管高通透性和滯留效應，讓抗癌藥物更好的富集于腫瘤組織，增強藥物的抗腫瘤效果。本實驗以美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的藥用高分子F127作為包載兩種抗癌藥物的高分子材料，該材料對難溶性藥物木犀草素有很好增溶作用，可以增強木犀草素細胞毒性作用，細胞試驗中，載雙藥膠束組比單用木犀草素和單用阿霉素有更好的細胞毒性作用就很好證明了這一點。同時，膠束包載抗癌藥物也能提高腫瘤細胞對藥物攝取，在包載木犀草素同時載入了阿霉素，兩種藥物作用于不同的亞細胞器，對細胞增殖抑制作用能有效疊加，能更好增加藥物治療肝癌的活性，在之后的體內動物實驗以及對不同組小鼠的腫瘤切片的病理檢測中，也能很好證明這一理論。另外，由于納米藥物載體特殊性還可以使抗腫瘤藥物具有一定被動腫瘤靶向作用，最終可以提高原發(fā)性肝癌治療療效。

[1] 鄭訪，李良平. 代謝綜合征與肝癌的流行病學研究[J]. 實用醫(yī)院臨床雜志，2013，10(3)：170-173.

[2] 楊穎，宋曙輝，徐桂花. 木犀草素的生理功能、提取、純化及應用的研究[J]. 食品工程，2010，(1)：19-23.

[3] Sasaki N，Toda T，Kaneko T，et al. Protective effects of flavonoids on the cytotoxicity of linoleic acid hydroperoxide toward rat pheochromocytoma PC12 cells[J].ChemBiol Interact，2003，145(1)：101-116.

[4] Bagli E，Stefaniotou M，Morbidelli L，et al. Luteolin inhibits vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis；inhibition of endothelial cell survival and proliferation by targeting phosphatidylinositol 3′-kinase activity[J].Cancer Res，2004，64(21) ：7936-7946.

[5] Cho HJ，Kim J，Nho CW，et al.Luteolin decreases IGF-II production and downregulates insulin-like growth factor-I receptor signaling in HT-29 human colon cancer cells[J].BMC Gastroenterol，2012，12(1)：9.

[6] 王洪燕，全康，蔣燕靈，等. 木犀草素抗腫瘤細胞增殖及增敏抗腫瘤藥物作用研究[J]. 浙江大學學報(醫(yī)學版)，2010，39(1)：30-36.

[7] 魏平平，張振海，金鑫，等. 木犀草素混合膠束的制備及其抗腫瘤活性研究[J]. 中國藥學雜志，2015，50(15)：1330-1334.

[8] Mizutani H，Tada-Oikawa S，Hiraku Y，et al.Mechanism of apoptosis induced by doxorubicin through the generation of hydrogen peroxide[J].Life Sci，2009，76(13)：1439-1453.

[9] 薛榮，趙倩，張毅，等. 透明質酸修飾的PAMAM納米膠束的制備及性質研究[J]. 中南藥學，2016，14(4)：345-350.

[10]魏亮，張軍峰，孟喜君. 索拉菲尼對人神經膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響[J]. 解剖科學進展，2016，22(2)：172-175.

[11]文雪. 姜黃素聯(lián)合抗TfR抗體體外抗膠質瘤效應研究[J]. 免疫學雜志，2016，32(4)：320-323.

[12]曾高峰，宗少暉，傅松文，等. PI3K/Akt/GSK-3β信號通路在6-姜酚保護PC12細胞對抗β淀粉樣蛋白誘導細胞凋亡的作用[J]. 天然產物研究與開發(fā)，2015，27：1862-1865.

[13]馬文轉，王金鈴，屠鵬飛. 鹽酸小檗堿納米膠束的制備、表征及體外抗腫瘤活性的研究[J]. 中國中藥雜志，2015，40(21)：4182-4188.

[14]尹曉蘭，張波，劉永軍，等. 聚合物藥物結合物膠束在抗腫瘤藥物遞送方面的研究進展[J]. 藥學學報，2016，51(5)：710-716.

[15]邵鋮祎，涂家生. 抗腫瘤聚合物膠束制劑的設計策略[J]. 藥學與臨床研究，2010，18(3)：286-290.

[16]狄紀君，郭衛(wèi)東，張惠潔，等. TACE聯(lián)合熱療治療原發(fā)性肝癌的臨床觀察[J]. 臨床腫瘤學雜志，2012，17(1)：42-46.

[17]張念華，陳高峰，史清華，等. 肝動脈栓塞化療聯(lián)合中藥治療原發(fā)性肝癌臨床觀察[J]. 新中醫(yī)，2012，44(2)：72-75.

[18]駱俊朋，胡鴻濤，郭晨陽，等. 吉西他濱熱化療灌注聯(lián)合卡鉑化療栓塞治療原發(fā)性肝癌臨床應用研究[J]. 介入放射學雜志，2013，22(6)：470-473.

[19]趙麗娟，劉東華，劉志紅，等. 多西他賽Pluronic F127聚合物膠束的制備與表征[J]. 中國生化藥物雜志，2011，32(2)：107-110，114.

[20]吳文婷，石文晶，吳瓊珠，等. 載多烯紫杉醇Solutol HS15/Pluronic F127混合膠束的制備及體外評價[J]. 藥學進展，2013，37(5)：222-229.

[21]張峻穎，余霜，張雷，等. 姜黃素Pluronic F127載藥膠束的制備及其膠束化行為的NMR分析[J]. 中國實驗方劑學雜志，2013，19(24)：1-4.

A basic study of combination of doxorubicin with luteolin for treatment of hepatocellular carcinoma

WANGJing-Xiu，LITao，ZHAOPing
(DepartmentofGastroenterology，GuangyuanPeople’sHospital，Guangyuan628017，China)

Objective In this study，we prepared micelles which loaded dual drugs luteolin and doxorubicin (DOX) to evaluate its anti-primary liver cancer activity and the pharmaceutical properties in vitro and in vivo.Methods The conventional solvent evaporation method was used to prepare the dual drug loaded micelles. The particle size of micelles was characterized by a laser granulometry. The release behavior in vitro of drug loaded micelles was evaluated by dialysis. The cell toxicity and the cellular uptake assays were employed to evaluate the anti-tumor activity. In addition，the dual drugs loaded micelles were used for in vivo pharmacology and anti-tumor evaluation.Results The dual drug loaded micelles showed uniform morphology with sizes (112.5±2.3)nm(n= 3). The dispersion index (PDI) was(0.152±0.014)and the encapsulation efficiency of the two anti-cancer drugs were both more than 80%. In vitro cytotoxicity experimental results revealed a low cytotoxicity of BSPs from micelles on human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 (P< 0.05，n= 5). The cellular uptake rate was improved. In vivo，the inhibitory effect on tumor-bearing mice was observed. The dual drug loaded micelles could significantly improve the survival rate of the mice(χ2=4.874，P< 0.05).Conclusion The micelles possess small size and high entrapment efficiency. The dual loaded micelles improve the cellular drug uptake and enhance the cytotoxicity to the tumor cells. Meanwhile，the special features of the nano-particles of dual drug loaded micelles have passive targeting effect which can provide a promising drug delivery system for primary liver cancer therapy.

Luteolin；DOX；Micelles；Primary liver cancer

四川省科技廳科技支撐計劃(編號：2011FZ0036)

R944

A

1672-6170(2016)06-0025-04

2016-03-14；

2016-08-30)