趙　康，孫天宇，馬志遠(yuǎn)，王國(guó)鑫，張海濤，尹國(guó)安，李井春

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

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不同濃度PVP對(duì)微膠囊化保存豬精子質(zhì)量的影響

趙康，孫天宇，馬志遠(yuǎn)，王國(guó)鑫，張海濤，尹國(guó)安，李井春

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

摘要：實(shí)驗(yàn)主旨為探討聚乙烯吡咯烷酮(PVP)濃度與豬精子微膠囊質(zhì)量的關(guān)系。使用含有不同濃度的PVP(0.1%，0.4%，0.8%)的豬精液稀釋液稀釋豬精液并制作微膠囊，使用全自動(dòng)精子質(zhì)量分析儀檢測(cè)在37℃條件下不同保存時(shí)間的精子質(zhì)量參數(shù)。在37℃條件下，0.4% PVP組與對(duì)照組、0.1% PVP和0.8% PVP組間相比精子活力要顯著高(P<0.05)；0.4% PVP組的精子直線速度也優(yōu)于其他各組；0.4% PVP組精子畸形率要比對(duì)照組、0.1% PVP組和0.8%組的要低(P<0.05)；在24 h內(nèi)對(duì)照組的精子釋放數(shù)最高，0.4% PVP組次之，0.8% PVP組最少。以上結(jié)果證實(shí)添加0.4% PVP在一定程度上能改善微膠囊化保存豬精子的質(zhì)量和微膠囊的緩釋率，為實(shí)現(xiàn)豬單次人工授精而受孕提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及理論支持。

關(guān)鍵詞：豬；精子；微膠囊；PVP；精子質(zhì)量

豬精子微膠囊化保存是一種新興的生物技術(shù)，由Faustini 等人的研究可知微膠囊是一種可以形成免疫隔離屏障的半透膜結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性，能阻遏免疫細(xì)胞以及引起免疫排斥反應(yīng)的大分子抗體，同時(shí)允許氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和一些具有生物活性的小分子物質(zhì)自由出入[1]。由Lim Fu等人的研究可知微膠囊可以維持適宜濃度的精子存活一段較長(zhǎng)的時(shí)間后仍具有受精的能力[2]。這就使把精子保存在微膠囊內(nèi)用來(lái)人工授精成為可能，因?yàn)槊繂挝粫r(shí)間都有精子從微膠囊內(nèi)釋放從而與卵子的排放時(shí)間相協(xié)調(diào)，理論上可以提高受精率。

聚乙烯吡咯烷酮(Pholyvinyl Pyrrolidone，PVP)是一種水溶性高分子化合物，具有成膜性、生物相容性、高分子表面活性等性能。據(jù)Yutaka 等人在2000年的研究表明PVP用于豬精子的稀釋液中可延緩精子的運(yùn)動(dòng)速度，減小精子的動(dòng)能損失從而延長(zhǎng)精子的保存時(shí)間[3]。由Dozortsev在1995年的研究可知PVP用在精子稀釋液中可以形成保護(hù)膜能減少外界環(huán)境對(duì)精子造成的損害?？梢允笴a2+波動(dòng)出現(xiàn)的時(shí)間延遲，從而阻礙精子提前獲能達(dá)到保存精子的目的[4]。這為PVP用于提高微膠囊化豬精子的保存提供理論依據(jù)。

由于制作精子微膠囊采用的材料和方法不同，所獲得微膠囊的質(zhì)量也有差異。優(yōu)化精子微囊制備條件，可以減少制作微膠囊時(shí)對(duì)精子的傷害，提高精子在體外及體內(nèi)的保存時(shí)間，從而提高受胎率。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)精液稀釋液中添加不同濃度PVP對(duì)膠囊化保存豬精子質(zhì)量及微膠囊緩釋率的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與藥品

豬精液(購(gòu)自大慶市春雷牧場(chǎng)，2～4歲長(zhǎng)白種公豬)、海藻酸鈉(Sigma,USA,Lot No.SLBM3663V)、氯化鋇(Lot# 20150913)、PVP(Sigma,USA,Lot No.BCBD3211V)、葡萄糖等。

精子稀釋液:80%(葡萄糖60g/L+HEPES 2.383g/L+NaHCO31.2g/L+青霉素0.0725g/L+鏈霉素0.05g/L)+20%卵黃液，0.1%PVP(精子稀釋液99.9%+PVP0.1%)，0.4%PVP(精子稀釋液99.6%+PVP0.4%)，0.8%PVP(精子稀釋液99.2%+PVP0.8%)，對(duì)照組:0.0%PVP(精子稀釋液100%)

精子釋放液:葡萄糖25.0423g/L+NaHCO32.1061g/L+NaCl 6.5426g/L+KCl 0.2015g/L+NaH2PO4·2H2O 0.04799g/L+Nalactate 1.868g/L+MgCl2·6H2O 0.1016g/L+HEPES 1.1915g/L+BSA6 mg/mL

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1豬精液的采集與制備

從健康的長(zhǎng)白豬種公豬采集新鮮的原精，用精子分析儀評(píng)估精子的活力、直線速度、畸形率等指標(biāo)，其中精子活率至少90%才可用于膠囊的制作。用0.1%PVP，0.4%PVP，0.8%PVP和0.0%PVP(對(duì)照組)把精子的濃度稀釋為1×108sperm/mL，保存在17℃恒溫箱內(nèi)，待制微膠囊。

1.2.2豬精子微膠囊的制作

把飽和氯化鋇溶液(保存在25℃室溫內(nèi))分別加入到用4種不同濃度PVP稀釋后的精液中，使Ba2+離子終濃度達(dá)到25mmol/L；得到的懸濁液輕輕搖勻，通過(guò)蠕動(dòng)泵讓其以60滴/min的速度通過(guò)25mm口徑的透明軟管(軟管口距離液面120mm)，滴入0.5%(w/v)海藻酸鈉溶液中；當(dāng)其接觸到液面時(shí)Ba2+從精液滴中擴(kuò)散與海藻酸鈉溶液相互作用，形成鋇-海藻酸鈉膜包裹的精液滴[5]；待微膠囊反應(yīng)20min，收集過(guò)濾微膠囊，用生理鹽水洗滌3次，備用。

1.2.3精子質(zhì)量評(píng)價(jià)

把制作好的豬精子微膠囊放置在稀釋液的培養(yǎng)皿中，保存在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，在不同的保存時(shí)間段內(nèi)用邁朗全自動(dòng)精子分析儀(CASA)進(jìn)行微膠囊化豬精子質(zhì)量檢測(cè)(主要評(píng)估精子的活力、直線速度、畸形率等)。

1.2.4微膠囊精子釋放率的檢測(cè)

把制作好的豬精子微膠囊裝在含有精子釋放液的離心管中并保存在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)(模擬自然狀態(tài)下精子在母豬體內(nèi)的生存環(huán)境)，在設(shè)定的時(shí)間梯度內(nèi)，用生物顯微鏡計(jì)算精子從微膠囊中釋放的數(shù)目。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用StatView5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的各項(xiàng)數(shù)據(jù)指標(biāo)進(jìn)行方差分析和多重比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果

2.137℃條件下，不同濃度PVP對(duì)微膠囊化保存的豬精子質(zhì)量的影響

2.1.1不同濃度PVP對(duì)微膠囊化保存豬精子活力的影響

由表1可知，在37℃保存下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，微膠囊化豬精子活力呈下降趨勢(shì)。在1 h時(shí)，對(duì)照組與0.1% PVP組間差異顯著(P<0.05)，其中對(duì)照組的活力最好，0.8% PVP組次之，0.1% PVP組最差。從保存6～12h，0.4%PVP組精子活力顯著高于其他組，在一定程度上提高精子在保存過(guò)程中的精子活力，0.4%PVP組的精子隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，精子活力下降的速度相對(duì)緩慢。

表1　不同濃度的PVP對(duì)微膠囊化保存精子活力的影響(%)

注：對(duì)照組沒(méi)有添加PVP，同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.2不同濃度PVP對(duì)微膠囊化保存豬精子直線速度的影響

由表2可知，在37℃保存下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，微膠囊化的豬精子直線速度呈下降趨勢(shì)。在30 min時(shí)，各組之間差異不顯著(P>0.05)；在1h 時(shí)，對(duì)照組和0.4%PVP組顯著高于0.1%和0.8PVP組；在保存3h時(shí)，對(duì)照組、0.4%PVP組與0.8%PVP組間差異顯著(P<0.05)；在6h時(shí)，0.8%PVP組與其他三組間差異顯著(P<0.05)，且其直線速度最低；在12h時(shí)，所有組中，0.4% PVP的精子直線速度最高；在24h時(shí)，對(duì)照組和0.4%PVP組的直線速度明顯高于0.8%PVP組，綜合以上結(jié)果來(lái)看，精液中0.4% PVP在一定程度上減緩精子直線速度的降低。

表2　不同濃度的PVP對(duì)微膠囊化保存精子直線速度的影響(μm/s)

注：對(duì)照組沒(méi)有添加PVP，同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.3不同濃度PVP對(duì)微膠囊化保存豬精子畸形率的影響

由表3可知，精子隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)微膠囊化豬精子畸形率呈上升趨勢(shì)。在30 min，1 h時(shí)，各組間精子的畸形率差異不顯著(P>0.05)；在3 h、6 h時(shí)，對(duì)照組、0.1%PVP、0.4% PVP組與0.8%PVP組之間差異顯著(P<0.05)，其中對(duì)照組的精子畸形率最高，0.8%PVP最畸形率最低；在12 h時(shí)，0.4% PVP組的畸形率最低；在24h時(shí)，對(duì)照組的精子畸形率最高，0.4% PVP組的最低。

表3　不同濃度的PVP對(duì)微膠囊化保存精子畸形率的影響(%)

注：對(duì)照組沒(méi)有添加PVP，同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.237℃條件下，不同濃度PVP對(duì)微膠囊化保存豬精子的精子釋放率的影響

由表4可知，在37℃保存下，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，精子的釋放數(shù)不斷增加。在保存2 h、4 h時(shí)，添加不同濃度PVP的微膠囊的精子釋放數(shù)差異不顯著(P>0.05)；在6 h時(shí)，對(duì)照組與0.8% PVP組間差異顯著(P<0.05)，0.8%PVP組的精子釋放率最低；在24 h時(shí)對(duì)照組的精子釋放率最高，0.4% PVP組次之，0.8% PVP組最少。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，添加PVP在一定程度上減緩精子從微膠囊釋放的速度，為精子微膠囊在雌性生殖道保存精子，延緩精子的釋放速度，使生殖道內(nèi)保持有一定活力精子數(shù)量，更有利于提高受胎率，但添加添加0.8%PVP大大減低了精子的釋放數(shù)量，可能會(huì)影響微膠囊的精子釋放。

表4　不同濃度的PVP對(duì)精子微膠囊釋放精子數(shù)量的影響(×104sperm/600μL)

注：對(duì)照組沒(méi)有添加PVP，同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3討論

3.137℃條件下，不同濃度PVP對(duì)微膠囊化保存的豬精子質(zhì)量的影響

在本次試驗(yàn)中，綜合比較37℃保存條件下，添加0.4%PVP對(duì)精子質(zhì)量的改善效果較好。這與陳東峰[6]等人的研究報(bào)道相似。PVP是一種大分子非活性聚合物，添加在精子稀釋液中可以使稀釋液變得黏稠，所以添加PVP組的精子直線速度要差于對(duì)照組。一般認(rèn)為精子的運(yùn)動(dòng)速度越小精子的能量損失越小，故添加PVP能延長(zhǎng)精子的保存時(shí)間。由陳靜[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，PVP作為稀釋液中的懸浮劑，可使保存過(guò)程中豬精子沉降堆積減慢，減少精子相互堆積時(shí)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在局部過(guò)度積累。所以添加PVP后精子的活力與畸形率都有不同程度的改善。但由Zhong研究結(jié)果可知，PVP有可能參與了微膠囊膜的形成[8]。這就可能使微膠囊內(nèi)的PVP濃度下降，進(jìn)而對(duì)精子的保存質(zhì)量效果不穩(wěn)定。

3.237℃條件下，不同濃度PVP對(duì)微膠囊化保存豬精子的精子釋放率的影響

本實(shí)驗(yàn)中，不同PVP濃度組與對(duì)照組間的精子釋放率只在6h時(shí)有差異，其他時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。由Vigo等人在2009年的實(shí)驗(yàn)可知，微膠囊化豬精子的釋放率與鋇-海藻酸鈉膜的通透性有關(guān)[9]。本次實(shí)驗(yàn)中添加了PVP，由龍宇升等人的實(shí)驗(yàn)可知，PVP是一種高分子聚合物，只需較低濃度就可大大增加溶液的黏度[10]。這將導(dǎo)致精子消耗大量的能量才能穿透鋇-海藻酸鈉膜，并且由于PVP具有成膜性這可能也會(huì)阻礙精子的通過(guò)，故只有很少部分的精子能從微膠囊中被釋放出且精子的釋放時(shí)間也將延后。

4結(jié)論

本試驗(yàn)添加0.4%PVP在一定程度上可以改善微膠囊化保存的豬精子質(zhì)量，為豬精子微膠囊在單次人工授精上的應(yīng)用提供理論參考。

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收稿日期:2016-04-05

作者簡(jiǎn)介：趙康 (1994-)，男，安徽人，動(dòng)物科學(xué)專業(yè)。

基金項(xiàng)目：黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目名稱：豬精子微膠囊的制備及應(yīng)用研究)；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)博士啟動(dòng)基金(B2012-07)。

通訊作者：李井春(1979-)，吉林長(zhǎng)春人，講師，博士，研究方向：動(dòng)物繁殖生物技術(shù)。

中圖分類號(hào)：S828.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-9737(2016)06-0001-02