陳東

(長沙市第一醫(yī)院 急診科,湖南 長沙　410005)

胃黏膜組織TNF-α及iNOS表達(dá)水平與胃炎發(fā)病及細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究

陳東

(長沙市第一醫(yī)院 急診科,湖南 長沙410005)

[摘要]目的：探討腫瘤壞死因子α(TNF- α)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)與胃炎發(fā)病及細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。方法：選取2012年2月至2014年3月間收治的112例胃炎患者作為研究組,56例健康受檢者作為對照組。所有受檢者入院次日進(jìn)行血壓、心率、肝功能、血常規(guī)等常規(guī)項檢查。研究組患者接受TNF- α、iNOS以及細(xì)胞凋亡檢查,再將患者按照病情嚴(yán)重程度分為輕度、中度、重度3組,比較組間差異；同時采用TUNEL法檢測患者胃黏膜組織的細(xì)胞凋亡情況,并采用Pearson相關(guān)性分析研究TNF- α及iNOS表達(dá)與胃炎發(fā)病和細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。結(jié)果：(1) 患者病情越嚴(yán)重TNF- α與iNOS水平越高,均明顯高于健康對照組。(2) 凋亡細(xì)胞形態(tài)、大小、染色較正常細(xì)胞均有明顯不同；同時,TNF- α≥1.0 ng·mg-1的陽性細(xì)胞指數(shù)(AI)顯著高于TNF- α<1.0 ng·mg-1,iNOS≥100個·mm-2時AI顯著高于iNOS<100 個·mm-2,TNF- α和iNOS不同亞組之間AI差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05。(3) 患者TNF- α和iNOS均與胃炎發(fā)病和細(xì)胞凋亡呈正相關(guān),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：TNF- α和iNOS的過量分泌可能引發(fā)胃炎患者胃黏膜的炎癥反應(yīng),二者還可能誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]腫瘤壞死因子α； 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶； 胃炎； 細(xì)胞凋亡

胃炎是一種常見的消化系統(tǒng)疾病,可由多種不同病因引起,常伴有黏膜炎癥反應(yīng)或上皮組織損傷,臨床表現(xiàn)為上腹脹、嘔吐、噯氣、食欲不振、反酸等[1]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)由激活的巨噬細(xì)胞分泌,具有顯著的抗腫瘤活性,是一種直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子[2]。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)是一種存在于神經(jīng)元及免疫細(xì)胞中的同工酶,可在細(xì)胞受到刺激時被激活生成大量NO,協(xié)助巨噬細(xì)胞對抗病原體[3]。研究表明,胃炎患者胃黏膜損傷及繼發(fā)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡與上述二者有關(guān)。因此,本研究探討了TNF-α和iNOS的表達(dá)與胃炎發(fā)病及細(xì)胞凋亡的相關(guān)性[4]。

1資料與方法

1.1一般資料

本研究對象為112例胃炎患者和56例健康受檢者,分別作為研究組和對照組。研究組男65例,女47例,平均年齡(36.7±13.7)歲；對照組男30例,女26例,平均年齡(38.8±11.4)歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 所有患者經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胃炎；(2) 受檢前未服用其他任何抗生素類、質(zhì)子泵抑制劑等含硝基類藥物。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 合并嚴(yán)重臟器功能性衰竭者；(2) 不能配合者；(3) 嚴(yán)重精神疾病者。試驗過程已通知所有患者及其家屬,并簽署知情同意書。兩組基本資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),詳見表1。

表1基本資料比較

Tab 1Comparison of basic data

組 別男∶女平均年齡/歲病程/年心率/次·min-1血壓/mmHg研究組65∶4736.7±13.73.5±2.374.2±5.789.4±6.3對照組30∶2638.8±11.4-73.5±4.887.8±5.2t/χ2值1.4621.102-1.7461.635P值>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

1.2方法

兩組入院次日進(jìn)行血壓、心率等常規(guī)項檢查。禁食10 h后于距幽門2.5 cm處的大彎、小彎、前壁、側(cè)壁各取2塊黏膜組織,分別用于TNF-α、iNOS的檢測。將研究組患者按照病情嚴(yán)重程度分為輕度、中度、重度3組,比較組間TNF-α、iNOS差異,同時分析其與胃炎發(fā)病和細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。

1.3檢查指標(biāo)及測定方法

1.3.1TNF-α的測定取胃黏膜組織洗滌干凈后稱重,加入生理鹽水后粉碎,3 500 r·min-1離心10 min取上層液,-4 ℃以下冷藏保存待測。采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定TNF-α水平,TNF-α水平(ng·mg-1)=TNF-α測得值(ng)/組織濕重(mg)。ELISA試劑盒由上海博谷生物科技有限公司提供；所使用儀器為全自動酶聯(lián)免疫分析儀(北京歐蒙生物技術(shù)有限公司)。

1.3.2iNOS的測定采用免疫組化方法測定iNOS,步驟如下：(1) 切片常規(guī)脫蠟至水；(2) 尿素消化30 min；(3) 1%H2O2封閉內(nèi)源酶30 min；(4) 加入羊血清37 ℃下保溫30 min；(5) 滴加一抗4 ℃12 h；(6) 分別滴加生物素化羊抗兔IgG和ABC復(fù)合物,37 ℃下依次保溫40 min；(7) 以DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)封片；(8) 黃色或棕黃色陽性信號出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)。400倍光鏡下觀察相對染色較強(qiáng)、陽性細(xì)胞較多的視野, 統(tǒng)計陽性染色細(xì)胞數(shù)目,iNOS(個·mm-2)=陽性染色細(xì)胞數(shù)目/視野面積。

1.3.3細(xì)胞凋亡的檢測采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡,步驟如下：取樣后以4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,脫蠟入水,3%H2O2處理10 min,TBS 1∶200稀釋、Proteinase K消化、TBS洗滌,然后依次加標(biāo)記緩沖液、封閉液、抗體稀釋液后以DAB顯色,蘇木素復(fù)染,最終洗滌脫水封片,于顯微鏡下觀察。細(xì)胞核中可見棕黃色顆粒者即為凋亡細(xì)胞。以陽性細(xì)胞指數(shù)(AI)評價細(xì)胞凋亡情況：每張切片隨機(jī)選取5個400倍視野,每個視野至少1 000個細(xì)胞,各個視野下陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值的均值即為AI(%)。

1.4病情判斷標(biāo)準(zhǔn)

所有患者根據(jù)胃黏膜的炎癥程度將病情分為輕度、中度、重度：(1) 重度：全黏膜層幾乎完全被炎癥細(xì)胞浸潤,并伴有黏膜上皮細(xì)胞壞死、變性等；(2) 中度：炎癥細(xì)胞浸潤面積為全黏膜層的1/3到2/3；(3) 輕度：炎癥細(xì)胞浸潤較輕,不超過全黏膜層的1/3[5]。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

本研究采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料以率表示,采用χ2檢驗；計量資料采用t檢驗,采用Pearson檢驗進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1TNF- α及iNOS與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性

患者病情越嚴(yán)重TNF-α與iNOS水平越高,且均明顯高于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05,詳見表2。

2.2TUNEL實驗結(jié)果

胃炎患者凋亡細(xì)胞體積小,細(xì)胞核染成棕色,形態(tài)呈多種不規(guī)則狀,大小不一,多分布于腺體各處。非凋亡細(xì)胞未見體積濃縮,細(xì)胞呈藍(lán)色,細(xì)胞核較大,形態(tài)多呈類圓形或橢圓形,大小較一致。健康對照組胃炎黏膜標(biāo)本少見凋亡細(xì)胞,主要分布于黏膜表層。TNF-α≥1.0 ng·mg-1的AI顯著高于TNF-α<1.0 ng·mg-1,iNOS≥100 個·mm-2時AI顯著高于iNOS<100 個·mm-2,TNF-α和iNOS不同亞組之間AI差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05。詳見表3。

表2TNF-α及iNOS與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性

Tab 2Correlation between TNF-α, iNOS and illness severity

組 別nTNF-α/ng·mg-1iNOS/個·mm-2輕度組550.57±0.1268.2±25.3中度組331.14±0.25122.7±34.6重度組241.92±0.17147.5±31.5對照組560.38±0.0810.5±2.1F組4.8698.274P組<0.01<0.01

表3各組患者AI比較

Tab 3Comparison of AI of patients in each group

指 標(biāo)nAI/%t值P值TNF-α/ng·mg-1≥1.04215.34±1.36<1.07011.45±1.923.759<0.05iNOS/個·mm-2≥1004813.54±0.94<1006410.76±1.025.346<0.05

2.3TNF- α和iNOS與胃炎發(fā)病、細(xì)胞凋亡的相關(guān)性

患者TNF-α和iNOS均與胃炎發(fā)病和細(xì)胞凋亡呈正相關(guān),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,見表4。

表4相關(guān)性分析

Tab 4Correlation analysis

指 標(biāo)胃炎發(fā)病細(xì)胞凋亡r值P值r值P值TNF-α0.6950.0030.7370.006iNOS0.5380.0020.7020.005

3討論

TNF-α是由巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。機(jī)體在疾病狀態(tài)下,TNF-α等炎癥因子升高,可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞移動,誘導(dǎo)其發(fā)生黏附及細(xì)胞穿出,干擾胃黏膜內(nèi)皮細(xì)胞的功能,使血流減少,從而造成胃黏膜損傷[6]。此外,TNF-α甚至可導(dǎo)致氧自由基的產(chǎn)生,并使溶酶體破裂,引起細(xì)胞凋亡。幽門螺桿菌感染時則可引起胃黏膜組織損傷,并激發(fā)炎癥性因子TNF-α的分泌,加劇組織損傷。

一氧化氮(NO)是人體內(nèi)的一種具有生物活性的分子[7],其主要來源于食物攝入的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化和NO合酶。 iNOS可調(diào)節(jié)NO,而iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量NO即為其產(chǎn)生病理作用的基礎(chǔ),在多種疾病發(fā)生發(fā)展的過程扮演重要角色。大量研究[8]表明,當(dāng)受到各種內(nèi)外刺激因素作用后iNOS表達(dá)顯著增加,促使NO過量表達(dá),可產(chǎn)生促炎促腫瘤的病理作用。研究[9- 10]發(fā)現(xiàn),抑制iNOS的表達(dá)或NO的產(chǎn)生可有效抑制胃炎和胃癌的發(fā)生。因此,胃黏膜炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)iNOS的表達(dá),iNOS的過度表達(dá)也會誘發(fā)胃炎的發(fā)生并加重病情。

本研究結(jié)果顯示,TNF-α與iNOS水平與患者病情有一定聯(lián)系,病情越嚴(yán)重TNF-α與iNOS水平越高,表2顯示輕、中、重度組均明顯高于健康對照組。同時,胃炎患者胃黏膜細(xì)胞有明顯細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡是指在某些生理或病理條件下,細(xì)胞受到某種信號的觸發(fā)后主動參與并遵循一定程序的死亡過程[11]。一般情況下細(xì)胞凋亡與增殖處于動態(tài)平衡狀態(tài),維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能,胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡異常可導(dǎo)致胃黏膜病變的發(fā)生[12]。本研究中胃炎患者凋亡細(xì)胞形態(tài)、大小、染色較正常細(xì)胞均有明顯不同；將患者分別按照TNF-α與iNOS水平各分為兩個亞組,發(fā)現(xiàn)TNF-α≥1.0 ng·mg-1時的AI顯著高于TNF-α<1.0 ng·mg-1,iNOS≥100 個·mm-2時AI顯著高于iNOS<100 個·mm-2,TNF-α和iNOS不同亞組之間AI差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05,推斷TNF-α與iNOS水平的提高可能是細(xì)胞凋亡的誘因[13]。另外,Pearson相關(guān)性分析顯示患者TNF-α和iNOS均與胃炎發(fā)病和細(xì)胞凋亡呈正相關(guān),可見患者TNF-α和iNOS表達(dá)與胃炎發(fā)病和細(xì)胞凋亡有顯著關(guān)聯(lián)[14]。

綜上所述,胃炎患者胃黏膜的炎癥及發(fā)病可能與TNF-α和iNOS的分泌有關(guān),TNF-α和iNOS的分泌還可能誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞凋亡,其具體作用靶點(diǎn)和機(jī)制尚不明確,有待進(jìn)一步研究[15]。

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Study on the relation of the expression of TNF-α,iNOS with apoptosis and gastritis

CHEN Dong

(DepartmentofEmergency,theFirstHospitalofChangshaCity,Changsha410005,China)

[Abstract]Objective： To study the relationship of the expression of TNF- α, inducible nitric oxide synthase(iNOS) and with apoptosis and gastritis. Methods: 112 patients with gastritis as a study group and 56 healthy volunteers of the same age as a control group were selected. All patients’ liver function, blood routine, blood pressure and heart rate were examined the next day in the hospital. Next, the study group was furthermore divided into 3 groups according to illness severity, the levels of TNF- α and iNOS were compared. Apoptosis was detected by TUNEL assay. Finally, Pearson correlation analysis methods were used to analyze the correlation on iNOS, TNF- α with gastritis and apoptosis. Results:(1) The more severe the disease, the higher the levels of iNOS and TNF- α would be. Moreover, both iNOS and TNF- α levels were significantly higher than those in the control group. (2) Apoptotic cells were significantly different from normal cells in morphology, size and TUNEL staining. At the same time, when TNF- α ≥1.0 ng·mg-1, AI was significantly higher than that when TNF- α<1.0 ng·mg-1. When iNOS≥100 mm-2, AI was significantly higher than that when iNOS<100 mm-2. (3) Both iNOS and TNF- α levels positively correlated with the incidence of gastritis and apoptosis with significant differences. Conclusion: Inflammatory reaction of gastric mucosa for patients with gastritis may be related to the secretion of TNF- α and iNOS and they may induce apoptosis of gastric mucosal cells.

[Key words]tumor necrosis factor α; inducible nitric oxide synthase; gastritis; apoptosis

[收稿日期]2015- 10- 12[修回日期] 2016- 02- 16

[作者簡介]陳東(1978-),男,湖南長沙人,副主任醫(yī)師,醫(yī)學(xué)碩士。E- mail:83547459@qq.com

[中圖分類號]R573.3; R329.25

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)03- 0370- 04

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03．017

[引文格式] 陳東.胃黏膜組織TNF-α及iNOS表達(dá)水平與胃炎發(fā)病及細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究 [J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2016,35(3):370- 373.

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