孫曉萌，　王　上，　叢麗娜，　李　成，　董　亮

大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034

季也蒙假絲酵母胞外多糖的分離純化及抗氧化活性研究

孫曉萌，王上，叢麗娜*，李成，董亮

大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034

摘要：對一株源于海參腸道的季也蒙假絲酵母產(chǎn)胞外多糖進(jìn)行分離純化并對其抗氧化活性進(jìn)行研究。采用乙醇沉淀、Sevag除蛋白等方法得到胞外粗多糖EPS。EPS經(jīng)Sepharose強(qiáng)陰離子交換層析分離后，分別得到3個(gè)組分EPS1、EPS2和EPS3，對抗氧化活性較高的EPS2采用Sephacryal凝膠過濾層析進(jìn)行純化，得到1個(gè)單一組分EPS2-1，采用氣相色譜法分析其單糖組成，并驗(yàn)證其抗氧化活性。結(jié)果表明：EPS2-1是由木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的；它具有較強(qiáng)的抗氧化活性，當(dāng)其濃度為0.36 mg/mL時(shí)，對羥基自由基的清除率可達(dá)100%，明顯高于同濃度下Vc對羥基自由基的清除率14.42%；當(dāng)EPS2-1濃度為0.60 mg/mL時(shí)，對超氧陰離子自由基的清除率可達(dá)53.22%；同時(shí)EPS2-1表現(xiàn)出一定的還原力。研究證明該活性多糖具有很好的應(yīng)用潛力，值得進(jìn)一步研究開發(fā)。

關(guān)鍵詞：季也蒙假絲酵母； 胞外多糖； 分離純化； 抗氧化活性； 組成分析

多糖是由多個(gè)單糖或其衍生物聚合而成的大分子物質(zhì)，對調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生命活動有著重要作用。多糖具有廣泛的藥理學(xué)活性，如免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等作用，有些多糖還具有抗放射損傷、抗化學(xué)劑、降血糖、降血脂等作用[1,2]，對人體健康有很大的促進(jìn)作用，因而越來越引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。微生物多糖是細(xì)菌、真菌和藍(lán)藻等微生物在代謝過程中產(chǎn)生的具有多種生物活性的高聚物[3]，以胞壁多糖、胞內(nèi)多糖和胞外多糖3種形式存在。微生物多糖具有安全無毒、理化性質(zhì)獨(dú)特、易與菌體分離及可通過深層發(fā)酵實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)良特性而倍受關(guān)注。與動植物多糖相比，微生物多糖生產(chǎn)周期短、成本低廉、不受季節(jié)、地域和病蟲害條件的限制，具有較強(qiáng)的市場競爭力和廣闊的發(fā)展前景[4]。

近年來，隨著對陸地微生物的大量開發(fā)，人們紛紛將目光投向海洋。海洋微生物處于低溫、高鹽、高壓、寡營養(yǎng)的特殊環(huán)境，具有產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能獨(dú)特的新型活性多糖的潛力[5]。Yang等[6,7]從中國黃海沉積物中分離到的絲狀真菌PhomaherbarumYS4108獲得胞外多糖，其由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和葡萄糖醛酸構(gòu)成，并具有很強(qiáng)的抗氧化活性。郭守東等[8]從愛德華氏細(xì)菌Edwardsiellatarda分離得到兩種甘露聚糖，抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明低分子質(zhì)量多糖的抗氧化活性更強(qiáng)，它們都具有一定清除羥基自由基的能力。孫海紅等[5]從海洋放線菌THW-7A分離鑒定出的兩種胞外多糖，皆具有清除超氧陰離子自由基和抗脂質(zhì)過氧化的能力。

海洋微生物多糖的研究主要集中在海洋細(xì)菌多糖，有關(guān)海洋酵母多糖的研究還較少。本研究以實(shí)驗(yàn)室從海參腸道中篩選出的季也蒙假絲酵母作為出發(fā)菌株生產(chǎn)并提取胞外多糖，充分利用色譜分離純化技術(shù)、各種化學(xué)分析方法和先進(jìn)的現(xiàn)代儀器分析技術(shù)對其胞外多糖進(jìn)行分離純化，并進(jìn)一步對胞外多糖的單糖組成及抗氧化活性進(jìn)行研究，為今后發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、活性更強(qiáng)的新型多糖奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

HS-J9季也蒙假絲酵母(Candidaguilliermind)由本實(shí)驗(yàn)室分離篩選并保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基 (g/L) ：葡萄糖20，蛋白胨 20，酵母膏 10，pH自然，121 ℃濕熱滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L) ：葡萄糖20，蛋白胨10，硫酸銨15，磷酸二氫鉀2.5，pH 6.6～6.7，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1菌種的活化及發(fā)酵培養(yǎng)

將保藏菌種接種至活化培養(yǎng)基中，于28 ℃，160 r/min條件下?lián)u床震蕩培養(yǎng)12 h ～16 h，活化后的種子液以4%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于相同條件下?lián)u床震蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2胞外多糖的提取

采用醇沉法對胞外多糖進(jìn)行粗提。將發(fā)酵液離心10 min(12 000 r/min，4 ℃)去除菌體沉淀，收集上清液，加入3倍體積的95%乙醇，于4 ℃條件下醇沉過夜。緩慢棄掉部分上清液，將剩余懸濁液離心，收集沉淀并用適量蒸餾水溶解，加入1/4體積Sevag試劑除去蛋白質(zhì)，上清液再次醇沉。將懸濁液離心，收集沉淀并用適量蒸餾水溶解，選用3 500 Da透析袋對其進(jìn)行透析，24 h后過0.22 μm濾膜除雜除菌，超濾濃縮后冷凍干燥即得粗多糖EPS。

1.2.3離子交換層析法分離粗多糖

采用Q Sepharose Fast Flow 強(qiáng)陰離子交換層析對粗多糖EPS進(jìn)行初步分離。用蒸餾水平衡柱，上樣后，用0～2 mol/L的NaCl溶液在室溫下進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為1 mL/min，用部分收集器每5分鐘收集一管，用苯酚-硫酸法檢測各管OD490nm值，繪制洗脫曲線。分別收集主峰進(jìn)行透析脫鹽，過濾膜除雜除菌，超濾濃縮后凍干備用。

1.2.4胞外多糖對羥基自由基清除能力的測定

采用Fenton反應(yīng)測定胞外多糖EPS1、EPS2和EPS3對羥基自由基的清除能力。參考劉鳳等[9]的實(shí)驗(yàn)方法，略作改動。清除率計(jì)算如下：[(A樣品-A空白) /(A對照-A空白)]×100%。

1.2.5胞外多糖對超氧陰離子自由基清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定胞外多糖EPS1、EPS2和EPS3對超氧陰離子自由基的清除能力。參考Cheng等[10]的實(shí)驗(yàn)方法，略作改動。清除率計(jì)算如下：[(ΔA對照-ΔA樣品)/ΔA對照]×100%。

1.2.6胞外多糖還原力的測定

采用普魯士藍(lán)法測定胞外多糖EPS1、EPS2和EPS3的還原力。參考郭巧玲等[11]的實(shí)驗(yàn)方法，略作改動。吸光度代表多糖的還原力。

1.2.7凝膠過濾層析法純化胞外多糖單組份

采用Sephacryl S-300 High Resolution凝膠過濾層析對胞外多糖EPS2做進(jìn)一步純化。流動相為0.2 mol/L NH4HCO3溶液，流速為0.3 mL/min，柱溫為4 ℃，用部分收集器每13分鐘收集一管，用苯酚-硫酸法檢測各管OD490 nm值，繪制洗脫曲線。合并主峰進(jìn)行透析脫鹽，過濾膜除雜除菌，超濾濃縮后凍干備用。

1.2.8胞外多糖單糖組成的分析

選用4 mol/L三氟乙酸對胞外多糖EPS2-1進(jìn)行水解，采用糖腈乙酸酯衍生法對胞外多糖水解得到的單糖樣品衍生后進(jìn)行氣相色譜分析，分析其單糖組成。參考楊靜等[12]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行衍生化，略作改動。以肌醇六乙酸酯為內(nèi)標(biāo)，選取的標(biāo)準(zhǔn)單糖分別為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

1.2.9胞外多糖抗氧化活性驗(yàn)證

分別采用Fenton反應(yīng)，鄰苯三酚自氧化法和普魯士藍(lán)法對胞外多糖EPS2-1的抗氧化活性進(jìn)行驗(yàn)證，以Vc作為對照。

2結(jié)果與討論

2.1胞外多糖的提取

采用乙醇沉淀、Sevag除蛋白、冷凍干燥等方法得到了胞外粗多糖EPS，稱其質(zhì)量得到產(chǎn)率。分別采用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法檢測多糖純度及蛋白質(zhì)含量，各項(xiàng)指標(biāo)如表1所示。

2.2胞外多糖EPS的分離

胞外多糖EPS經(jīng)Sepharose強(qiáng)陰離子交換層析進(jìn)行線性梯度洗脫，以O(shè)D490nm值和NaCl濃度對洗脫體積作圖，繪制洗脫曲線。如圖1所示，從圖中可見共分離得到3個(gè)組分，分別命名為EPS1、EPS2和EPS3。

表1　粗多糖EPS的理化性質(zhì)及產(chǎn)率

圖1　EPS的Q Sepharose F. F. 線性洗脫曲線

2.3胞外多糖EPS1、EPS2和EPS3對羥基自由基清除能力的測定

羥基自由基是一種氧化能力很強(qiáng)的自由基，對生物組織具有較強(qiáng)的危害，它可以通過多種方式與細(xì)胞內(nèi)生命物質(zhì)作用，使其遭受損傷和破壞[13]。以羥基自由基的清除率對EPS1、EPS2和EPS3的濃度作圖。結(jié)果如圖2所示，隨著多糖樣品濃度的增加清除羥基自由基的能力也逐漸增強(qiáng)，其中多糖EPS2的變化率最大，EPS3次之。當(dāng)多糖樣品濃度達(dá)到0.20 mg/mL時(shí)，多糖EPS1、EPS2和EPS3對羥基自由基的清除率分別為40.40%、86.87%和70.71%。

圖2　EPS1、EPS2和EPS3對羥基自由基的清除率

在所測濃度范圍內(nèi)，它們對羥基自由基的清除能力按照從強(qiáng)到弱的順序是：EPS2>EPS3>EPS1，且多糖EPS2明顯高于EPS1和EPS3。

2.4胞外多糖EPS1、EPS2和EPS3對超氧陰離子自由基清除能力的測定

超氧陰離子自由基是生物體系中自由基的根源，除了本身有毒害外，它可通過歧化反應(yīng)產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的H2O2和羥基自由基，導(dǎo)致細(xì)胞DNA和細(xì)胞膜的損傷[14]。以超氧陰離子自由基的清除率對EPS1、EPS2和EPS3的濃度作圖。結(jié)果如圖3所示，在0.05 mg/mL ～0.30 mg/mL濃度范圍內(nèi)，多糖EPS1、EPS2和EPS3均表現(xiàn)出一定的清除超氧陰離子自由基的能力，并且隨著多糖濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)多糖樣品濃度達(dá)到0.30 mg/mL時(shí)，多糖EPS1、EPS2和EPS3對超氧陰離子自由基的清除率分別為24.18%、29.23%和19.15%。在所測濃度范圍內(nèi)，它們對超氧陰離子自由基的清除能力按照從強(qiáng)到弱的順序是：EPS2>EPS1>EPS3，且多糖EPS2明顯高于EPS1和EPS3。

圖3　EPS1、EPS2和EPS3對超氧陰離子

2.5胞外多糖EPS1、EPS2和EPS3還原力的測定

還原力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，可以通過提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的物質(zhì)，以中斷自由基的連鎖反應(yīng)[15]。相關(guān)研究證實(shí)，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)，因此，可通過測定還原力來說明其抗氧化活性的大小。以EPS1、EPS2和EPS3的OD700 nm對濃度作圖，吸光度代表多糖的還原力。結(jié)果如圖4所示， 3種多糖的還原力均不是很強(qiáng)，但隨著多糖濃度的增加，還原力逐漸增大。當(dāng)多糖濃度為0.18 mg/mL時(shí)，多糖EPS1、EPS2和EPS3在700 nm處的吸光度值分別為0.118、0.080和0.093，在所測濃度范圍內(nèi)，多糖EPS1的還原力最大，EPS3次之。

圖4　EPS1、EPS2和EPS3的還原力

2.6胞外多糖EPS2的純化

綜合以上實(shí)驗(yàn)，選取抗氧化活性較高的胞外多糖EPS2做進(jìn)一步純化和分析。EPS2經(jīng)Sephacryl凝膠過濾層析進(jìn)行純化，以O(shè)D490 nm值對洗脫管數(shù)作圖，繪制洗脫曲線。如圖5所示，洗脫后只得到1個(gè)單一組分，命名為EPS2-1。

圖5　EPS2的Sephacryl S-300 HR洗脫曲線

2.7胞外多糖EPS2-1單糖組成分析

標(biāo)準(zhǔn)單糖和胞外多糖EPS2-1水解樣品的氣相色譜圖如圖6所示。根據(jù)各種標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間可知圖6-A中的7個(gè)主峰從左至右依次為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和內(nèi)標(biāo)物。對比圖6-A和圖6-B可知，胞外多糖EPS2-1是由木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的，采用內(nèi)標(biāo)法定量分析可得木糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖的摩爾比為1∶35.98∶1.22∶1.68。

圖6　6種標(biāo)準(zhǔn)單糖(A)和EPS2-1(B)的氣相色譜圖

2.8胞外多糖EPS2-1抗氧化活性驗(yàn)證

對胞外多糖EPS2-1的抗氧化活性進(jìn)行驗(yàn)證，以Vc作為對照，結(jié)果如圖7所示。由圖7-A可見，多糖EPS2-1清除羥基自由基的能力要明顯高于Vc，并且隨著濃度的增大清除率有大幅的增加，當(dāng)EPS2-1濃度為0.36 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)100%，而此時(shí)Vc對羥基自由基的清除率僅為14.42%。由圖7-B可見，雖然多糖EPS2-1對超氧陰離子自由基的清除能力不及Vc，但其仍具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基的能力，并且清除率隨濃度的增加而增大，當(dāng)EPS2-1濃度為0.60 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)53.22%。由圖7-C可見，相對于Vc而言，多糖EPS2-1的還原力較低，但其仍具有一定的還原力，并且隨著濃度的增加還原力緩慢增大，當(dāng)EPS2-1濃度為0.36 mg/mL時(shí)，代表還原力大小的OD700 nm值為0.175。

A. 羥基自由基清除率

B. 超氧陰離子自由基清除率

C. 還原力

3結(jié)論

自由基是生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生的一類可單獨(dú)存在，具有高度氧化活性，帶有一個(gè)或幾個(gè)未配對電子的分子或原子，其化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)活潑[16]。在正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡之中，當(dāng)自由基的存在超出機(jī)體防護(hù)系統(tǒng)所具有的清除能力，就會直接或間接的引起蛋白質(zhì)變性、酶失活、多糖降解、DNA鏈斷裂、生物膜結(jié)構(gòu)損傷、細(xì)胞解體乃至機(jī)體病變和死亡[17]。自由基被稱為“萬病之源”，其中羥基自由基和超氧陰離子自由基是最主要的形式，是機(jī)體代謝中產(chǎn)生的極為活躍的自由基。本研究中純化后的季也蒙假絲酵母胞外多糖EPS2-1具有明顯的抗氧化活性，對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力很強(qiáng)，當(dāng)其濃度為0.36 mg/mL時(shí)，對羥基自由基的清除率可達(dá)100%，明顯高于同濃度下Vc對羥基自由基的清除率14.42%；當(dāng)EPS2-1濃度為0.60 mg/mL時(shí)，對超氧陰離子自由基的清除率可達(dá)53.22%；同時(shí)EPS2-1表現(xiàn)出一定的還原力。因此，多糖EPS2-1作為天然抗氧化劑具有良好的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步研究開發(fā)。

參考文獻(xiàn)

[1]何朝勇，王立為．多糖的免疫調(diào)節(jié)作用綜述 [J]．安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21(4)：62-64．

[2]趙琳靜，宋小平，黎方雅．多糖及其衍生物抗氧化性質(zhì)的研究進(jìn)展 [J]．上海工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，22(1)：44-47．

[3]劉汝冰，賈薇，蔣蕓等．微生物多糖WL-26深層發(fā)酵工藝的優(yōu)化 [J]．工業(yè)微生物，2008，38(6)：43-48．

[4]郭敏，張寶善，金曉輝．微生物發(fā)酵生產(chǎn)多糖的研究進(jìn)展 [J]．微生物學(xué)通報(bào)，2008，35(7)：1084-1090．

[5]孫海紅，毛文君，錢葉苗等．海洋微生物活性胞外多糖的研究進(jìn)展 [J]．海洋科學(xué)，2011，35(11)：134-137．

[6]Yang XB，Gao XD，Han F，etal．Sulfation of a polysaccharide produced by a marine filamentous fungusPhomaherbarumYS4108 alters its antioxidant poperties in vitro [J]．Biochimica et Biophysica Acta，General Subjects，2005，1725(1)：120-127．

[7]Yang XB，Gao XD，Han F，etal．Purification，characterization and enzymatic degradation of YCP，a polysaccharide from marine filamentous fungusPhomaherbarumYS4108 [J]．Biochimie，2005，87(8)：747-754．

[8]Guo SD，Mao WJ，Han Y，etal．Structural characteristics and antioxidant activities of the extracellular polysaccharides produced by marine bacteriumEdwardsiellatarda[J]．Bioresource Technology，2010，101(12)：4729-4732．

[9]劉鳳，葉淑紅，王際輝等．海洋假單胞菌pf-6胞外多糖吸濕保濕和抗氧化性研究 [J]．食品工業(yè)科技，2011，32(11)：68-71．

[10]Cheng YK，Li L，Meng ZK，etal．Component analysis and free radicals scavenging activity ofPhysalisalkekengiL．polysaccharide [J]．Science Direct，2008，24(2)：167-170．

[11]郭巧玲，謝建華，楊學(xué)敏等．菠蘿多糖抗氧化功能的研究 [J]．農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2012，2(3)：50-53．

[12]楊靜，丁重陽，顧正華等．以豆?jié){為培養(yǎng)基的三種藥食用真菌發(fā)酵過程多糖變化的研究 [J]．工業(yè)微生物，2015，45(5)：17-22．

[13]王宗君，廖丹葵．茶樹菇多糖抗氧化活性研究 [J]．食品研究與開發(fā)，2010，31(1)：50-54．

[14]Dreher D，Junor AF．Role of oxygen free radicals in cancel development [J]．European Journal of Cancer，1996，32(1)：30-35．

[15]Duh PD，Du PC，Yen GC．Action of methanolic extract of mung BEAN hulls as inhibitors of peroxidation and non-lipid oxidative damage [J]．Food and Chemical Toxicology，1999，37(11)：1055-1061．

[16]方允輝，榮梁．自由基生物學(xué)的理論與應(yīng)用 [M]．北京：科學(xué)出版社，2002．

[17]Marx JL．Oxygen free radicals linked to many diseases [J]．Science，1987，235(4788)：529-531．

Isolation, purification and antioxidant activity of exopolysaccharides fromCandidaguilliermind

SUN Xiao-meng, WANG Shang, CONG Li-na, LI Cheng, DONG Liang

School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034

AbstractIn order to study the antioxidant activity in vitro, the exopolysaccharides were extracted from the culture of Candida guilliermind isolated from sea cucumber intestine. The fermentation liquor was treated with ethanol and sevag reagent to get the exopolysaccharides (EPS). Then three components (EPS1, EPS2, EPS3) were separated by Sepharose anion exchange chromatography. The antioxidant activity of EPS2 was found more potent compared to the other two components. The purified exopolysaccharides (EPS2-1) were obtained by Sephacryal chromatography. Gas chromatography was employed for the component analysis of EPS2-1 and the antioxidant activity of EPS2-1 was verified in vitro.The results indicated that EPS2-1 was composed of xylose, mannose, glucose and galactose. Moreover, EPS2-1 possessed the strong antioxidant activity. The scavenging rate of ·OH radical could reach to 100% when the EPS2-1 concentration was 0.36 mg/mL. This result was much higher than that of Vc (14.42%) at the same concentration. When the EPS2-1 concentration reached to 0.60 mg/mL, the scavenging rate of was about 53.22%. Meanwhile, the EPS2-1 also had some reducing power. Based on above results, these active polysaccharides had more application potential for further study and development.

Key wordsCandida guilliermind; exopolysaccharides; isolation purification; antioxidant activity; component analysis

doi:10.3969/j.issn.1001-6678.2016.02.005

基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(LZ2014029)，遼寧省研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2014-154)，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心開放實(shí)驗(yàn)室(2012FU125X03)。

作者簡介：孫曉萌(1990～)，女，碩士研究生。E-mail:158674545@qq.com。 *通訊作者: 叢麗娜(1962～)，女，教授。E-mail:linacong@163.com。