段琳琳，　李紅梅

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093

來源于大腸桿菌的NMN轉(zhuǎn)移酶的克隆表達與酶學(xué)性質(zhì)研究

段琳琳，李紅梅*

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093

摘要：在生物體內(nèi)，NMN(煙酰胺單核苷酸)轉(zhuǎn)移酶能夠催化NMN生成NAD。本研究通過構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET30α(+)-Nmnat，成功實現(xiàn)來源于大腸桿菌的NMN轉(zhuǎn)移酶基因(Nmnat)的原核表達。從大腸桿菌基因組中克隆得到的NMN轉(zhuǎn)移酶基因長度為1 245 bp，所編碼的重組酶分子量 45 kDa。對重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進行分析，結(jié)果顯示該酶最適反應(yīng)溫度和pH分別為37 ℃和7.5。4 ℃下，該酶的熱失活半衰期可長達990.2 min。Mn2+、Fe2+對該酶的酶活的激活作用顯著，而EDTA對酶活能造成明顯的抑制作用。酶動力學(xué)分析結(jié)果顯示，該酶對底物NMN催化的Km和Vmax分別為16.89 mmol/L和2.46 μmol/(L·min)。該NMN轉(zhuǎn)移酶基因在大腸桿菌宿主中的成功表達，為NAD生物合成應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌； NMN轉(zhuǎn)移酶； 克隆表達； 酶學(xué)性質(zhì)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，簡稱輔酶I)，作為一種轉(zhuǎn)遞質(zhì)子輔酶[1]，參與生物體內(nèi)的多種 氧化反應(yīng)，如細胞物質(zhì)代謝、能量合成、細胞DNA修復(fù)等[2-3]，在細胞生命活動起著至關(guān)重要的作用[4-5]。在生物代謝途徑中, NAD的合成主要以煙酰胺單核苷(NMN) 和ATP為前體，在NMN轉(zhuǎn)移酶催化作用下,生成NAD和焦磷酸鹽。

研究發(fā)現(xiàn)NMN轉(zhuǎn)移酶是唯一一種能夠催化細胞核內(nèi)NAD合成的生物酶，其類型有3種，分別是Nmnat1、Nmnat2和Nmnat3，且其分子量大小，性質(zhì)以及特征隨著在組織細胞中的分布位置不同出現(xiàn)差異[6-7]。NMN轉(zhuǎn)移酶對細胞的存活也十分重要，可以降低對由基因引起的軸突變性[8-11]，加快真核細胞的有絲分裂， 從而降低生物細胞的衰老和死亡[12]，也可作為生物藥劑的靶標用于提高抗腫瘤藥物的生物活性[13-14]。

目前NMN轉(zhuǎn)移酶研究主要集中于酶活測定、酶分子結(jié)構(gòu)、催化反應(yīng)機制和體內(nèi)代謝途徑等方面，而對酶基因進行重組表達的報道卻相對較少[15]。本文運用PCR技術(shù)從大腸桿菌中獲取NMN轉(zhuǎn)移酶基因，構(gòu)建表達NMN轉(zhuǎn)移酶的重組菌，以期獲得具有良好催化性能的NMN轉(zhuǎn)移酶，并對重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進行研究，為NAD生物合成應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒和試劑

大腸桿菌BL21(DE3)、質(zhì)粒pET30α(+)由實驗室保存。

1.1.2工具酶和試劑

TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHI和NdeI、T4DNA連接酶、蛋白質(zhì)標準分子量、DNA標準分子量購于TaKaRa公司。異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自上海生工生物工程公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：采用LB培養(yǎng)基。磷酸鹽緩沖液(g/L)：KH2PO423.1，K2HPO4125.4。121 ℃下滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：采用TB培養(yǎng)基。121 ℃下滅菌20 min。冷卻至60 ℃后再添加磷酸鹽緩沖液。固體培養(yǎng)基中加2%的瓊脂。培養(yǎng)基中按需添加終濃度為30 μg/mL的硫酸卡那霉素。

1.2方法

1.2.1NMN轉(zhuǎn)移酶基因的克隆

以大腸桿菌的基因組DNA為模板(GI:61676796)，設(shè)計引物PCR擴增NMN轉(zhuǎn)移酶(Nmnat)編碼基因。上游引物P1：5’-CATCATATG TAGTCCTTATGCCTCCTCT-3;下游引物P2：5’-GTAGGATCCTAGAGCTGTC CGGAGAAGGTCT-3’，引物兩端分別引入BamHI和NdeI酶切位點，具體操作參見文獻[16]。PCR擴增條件：95 ℃，3 min，50 ℃，2 min, 72 ℃，1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物跑電泳切膠回收目的片段。

1.2.2大腸桿菌表達載體的構(gòu)建

將目的基因片段用BamHI和NdeI雙酶切后切膠回收，再與雙酶切后切膠回收的pET30α(+)載體片段在16 ℃下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布抗性平板，37 ℃下培養(yǎng)過夜。挑取陽性轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒并送上海生工測序，含正確克隆序列的質(zhì)粒命名為pET30α(+)-Nmnat。

1.2.3目的基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達

將含有重組表達質(zhì)粒pET30α(+)-Nmnat的E.coliBL21(DE3)單菌落接種于10 mL的LB液體管(含30 μg/mL的硫酸卡那霉素)中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后以1%接種量接入100 mL TB液體培養(yǎng)基(含30 μg/mL硫酸卡那霉素)中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5～0.7時，加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度30 μg/mL，在25 ℃下誘導(dǎo)表達8 h，離心收集菌體用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5)重懸，冰上超聲破碎(4 s，間隔6 s，60次，功率300 W)，然后4 ℃，12 000 r/min下離心20 min去除細胞碎片，取上清進行SDS-PAGE分析并測酶活。

1.2.4SDS-PAGE分析

制備10%的分離膠和5%的濃縮膠，在80 V和120 V的電壓下進行不連續(xù)垂直平板電泳，凝膠用考馬斯亮藍染色。

1.2.5NMN轉(zhuǎn)移酶活力測定

NAD酶活力的檢測原理：

反應(yīng)體系:1 mol/L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液，300 mmol/L NMN，50 mmol/L ATP，50 mmol/L Mn2+，乙醇2%，適量酶液，7U的ADH(乙醇脫氫酶)，混勻，置37 ℃水浴中振蕩反應(yīng)2 h，加0.155 mol/L的EDTA終止酶反應(yīng)，5 min后冰浴冷卻，8 000 r/min下離心1 min，上清液在340 nm處測定吸光值，以O(shè)D340代表NMN轉(zhuǎn)移酶酶活力大小。酶活單位(U)定義：37 ℃，pH 7.5條件下，1 min催化1 μmol NMN所需的酶量。比酶活用U/mg或U/g表示。

1.2.6重組酶性質(zhì)分析

酶的最適溫度研究：分別于20 ℃、30 ℃、37 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃下測定酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度。

酶的熱失活曲線與失活動力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)計算：

將酶分別置30 ℃、37 ℃、50 ℃下保溫，每隔30 min冰浴冷卻離心取樣測定殘余酶活，繪制酶熱失活曲線。根據(jù)公式(1)～(3)計算出熱失活速率常數(shù)Ki、半衰期t1/2和吉布斯自由能ΔG。

(1)

失活半衰期公式t1/2=ln2/Ki

(2)

吉布斯自由能的計算公式[15]為

ΔG=-2.303RTlg(Kih/KBT)

(3)

酶的最適pH研究：在不同pH(pH 4.0～10.0，1 mol/L的緩沖液)下測定酶活，確定酶的最適反應(yīng)pH。

酶的pH穩(wěn)定性：酶在37 ℃下，1 mol/L的緩沖液(pH 4.0～10.0)中保溫2 h后冰浴冷卻5 min測定殘余酶活。

金屬離子和EDTA對酶活力的影響：在最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH下，分別添加不同金屬離子和EDTA(終濃度50 mmol/L)，分別測定其對酶促反應(yīng)的影響。以不加金屬離子或EDTA作為對照。

反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Km及Vmax的測定：調(diào)整反應(yīng)體系中底物NMN的濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L和5 mmol/L，測定NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活，根據(jù)底物濃度和相應(yīng)的反應(yīng)初速率，用Michaelis-Menten方程計算米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax值。

2結(jié)果與分析

2.1目的基因克隆和重組表達質(zhì)粒構(gòu)建

從大腸桿菌基因組中PCR擴增出NMN轉(zhuǎn)移酶編碼基因，陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒雙酶切驗證(圖1)，正確者送測序，結(jié)果顯示克隆片段長1 245 bp，與大腸桿菌的Nmnat基因序列同源性為99%，表明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將重組質(zhì)粒pET30α(+)-Nmnat轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，進行目的基因誘導(dǎo)表達，將表達后的細胞破碎液上清進行SDS-PAGE分析。如圖2所示，以空載質(zhì)粒為對照，在45 kDa處出現(xiàn)特征條帶，且與目標蛋白的理論計算值吻合，說明目的基因在大腸桿菌宿主中成功實現(xiàn)了異源表達。

M: DNA相對分子質(zhì)量標準；1：PCR產(chǎn)物；2：陰性對照；3:重組表達質(zhì)粒pET30α(+)-Nmnat經(jīng)BamHI和NdeI雙酶切后的產(chǎn)物

圖1瓊脂糖電泳檢測DNA

泳道M：蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；泳道1：E.coliBL21(DE3)經(jīng)超聲破碎后的上清；泳道2：稀釋10倍誘導(dǎo)表達8 h后，含pET30α(+)的E.coliBL21(DE3)經(jīng)超聲破碎后的上清；泳道3：稀釋5倍誘導(dǎo)表達8 h后，含pET30α(+)-Nmnat的E.coliBL21(DE3)經(jīng)超聲破碎后的上清

圖2目的基因在E.coliBL21(DE3)中的表達

2.2重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1重組酶的最適反應(yīng)溫度

如圖3所示，在20 ℃～37 ℃內(nèi)，隨溫度升高，酶活性逐漸升高；當反應(yīng)溫度超過37 ℃，酶活性迅速下降。因此確定該酶最適反應(yīng)溫度為37 ℃，與已報道的其它來源的NMN轉(zhuǎn)移酶的最適溫度相同[ 17-18]。

圖3　重組酶的最適反應(yīng)溫度

2.2.2重組NMN轉(zhuǎn)移酶的熱失活動力學(xué)和熱力學(xué)分析

結(jié)果如圖4和圖5所示。從圖中可看出，重組NMN轉(zhuǎn)移酶的失活符合一級失活反應(yīng)規(guī)律。熱失活速率常數(shù)和半衰期自由(ΔG)的結(jié)果如表1所示。該酶在4 ℃時半衰期長達990.2 min，而60 ℃時，酶的穩(wěn)定性較差，半衰期僅為2.5 min。文獻數(shù)據(jù)顯示，吉布斯自由能的數(shù)值大小與酶的熱穩(wěn)定性相關(guān)。ΔG越高，代表酶的穩(wěn)定性越好[15]。因此，從吉普斯自由能角度可發(fā)現(xiàn)，在20 ℃、30 ℃、37 ℃時，重組NMN轉(zhuǎn)移酶的ΔG較高，這也進一步說明，在低溫時該酶的穩(wěn)定性較好，當溫度高于37 ℃時，ΔG開始降低，表明該酶的穩(wěn)定性下降。

縱坐標：相對殘留酶活力的對數(shù)；曲線斜率：熱失活的一級速率常數(shù)Ki

圖4重組NMN轉(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性

ln Ae/A0：相對酶活力的對數(shù)；曲線斜率：熱失活的一級速率常數(shù)Ki

T/℃Ki/min-1ΔG/KJ·mol-1t1/2/min40.000485.76990.2200.001587.62462.1300.002389.62301.4370.003091.06231.1500.079886.178.7600.274185.512.5

2.2.3重組酶的最適反應(yīng)pH

環(huán)境pH可影響酶催化活性位點上相關(guān)基團的解離及底物的解離狀態(tài)，進而影響酶的催化性能。本研究考察了該重組NMN轉(zhuǎn)移酶在不同的pH值下催化NMN轉(zhuǎn)化為NAD的變化情況。如圖6所示，重組酶最適反應(yīng)pH為7.5，當pH大于8時酶活迅速降低。該重組酶的最適反應(yīng)pH與炭疽桿菌細胞NMN轉(zhuǎn)移酶最適pH相同[19]。

2.2.4重組NMN轉(zhuǎn)移酶的pH穩(wěn)定性

反應(yīng)體系的pH可以影響酶的空間構(gòu)象和穩(wěn)定性[19]。重組NMN轉(zhuǎn)移酶的pH穩(wěn)定性如圖7所示，pH 7.0～8.0時酶的穩(wěn)定性較好，酶活性保持在80%以上；當pH低于5.5或高于9時，酶的活性明顯降低。這可能是由于在偏酸或偏堿的環(huán)境中，重組酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活降低。

圖6　重組NMN轉(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)pH

圖7　pH對重組NMN轉(zhuǎn)移酶穩(wěn)定性的影響

2.2.5金屬離子及EDTA對酶活的影響

某些酶需要金屬離子作為輔助因子[20]。本研究考察了不同的金屬離子及EDTA對酶活的影響。如圖8所示，F(xiàn)e2+和Mn2+能顯著提高重組NMN轉(zhuǎn)移酶的活性；而Ca2+、Zn2+、Mg2+對酶活促進作用不明顯；Fe3+起抑制酶活的作用；當在反應(yīng)體系中添加金屬螯合劑EDTA，酶活顯著下降。

圖8　金屬離子及EDTA對酶活的影響

2.2.6重組NMN轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)測定

本研究采用雙倒數(shù)法測定重組NMN轉(zhuǎn)移酶的Km及Vmax，結(jié)果如圖9所示。該重組酶的Km為16.89 mmol/L。該重組酶的Km值與來源于哺乳動物細胞核內(nèi)的NMN轉(zhuǎn)移酶的Km接近[2]，但低于來源于人體組織的NMN轉(zhuǎn)移酶的Km[7]及來源于炭疽桿菌細胞的NMN轉(zhuǎn)移酶的Km[18](表2)。

圖9　重組NMN轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)測定

來源最適反應(yīng)pH最適反應(yīng)溫度/℃Kcat/s-1Km分子量Mr/kDa大腸桿菌7.53712.1316.8945哺乳動物細胞核人體啤酒酵母炭疽桿菌細胞7.56.0-9.05.0-9.07.53737373710.73--16.22±2/20.67±1.914.660.023/0.091-0.5435[2]31.9/34.4[7]48[17]49[18]

3結(jié)論

(1) 本研究利用基因工程技術(shù)將重組表達質(zhì)粒pET30α(+)-Nmnat轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中進行目的基因的異源表達。SDS-PAGE分析顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8 h后，目的基因成功表達，重組酶分子量45 kDa。

(2) NMN轉(zhuǎn)移酶有三種同源體，不同來源的性質(zhì)差異顯著。本文深入研究來源于大腸桿菌的重組NMN轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)，重組酶最適反應(yīng)溫度和pH分別為37 ℃、7.5。Mn2+和Fe2+對該酶具有明顯的激活作用，而EDTA則可以顯著抑制酶活性。另外，通過動力學(xué)分析熱失活常數(shù)、pH穩(wěn)定性及酶動力學(xué)參數(shù)測定，以及與不同來源的NMN轉(zhuǎn)移酶進行比較，結(jié)果表明，該重組酶對底物NMN的親和力水平與來源于哺乳動物細胞核的NMN轉(zhuǎn)移酶相近，但遠低于來源于人體的NMN轉(zhuǎn)移酶，后續(xù)可考慮采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)進一步增強該酶的底物親和力。

本研究成功構(gòu)建了能高效表達大腸桿菌NMN轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌，并對該重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了系統(tǒng)研究，為后續(xù)NAD生物合成提供了有價值的技術(shù)參考。

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Cloning, expression and characterization of NMNadenylyltransferase fromEscherichiacoli

DUAN Lin-lin, LI Hong-mei

University of Shanghai for Science and Technology, School of Medical Instrument and Food Engineering, Shanghai 200093, China

AbstractNMN (Nicotinamide mononucleotide) adenylyltransferase can catalyze NMN to generate NAD in vivo. The gene encoding NMN adenylyltransferase was amplified from the genomic DNA of E. coli and was overexpressed in E. coli BL21(DE3) by using the recombinant expression plasmid pET30a(+). The results showed that a gene fragment of 1 245 bp and its encoding protein of 45 kDa were obtained. The optimal reaction temperature and pH of recombinant enzyme was 37 ℃ and 7.5, respectively. The thermo-inactivation half-life of the enzyme at 4 ℃ was up to 990.2 min. Mn2+and Fe2+stimulated the enzyme, while EDTA remarkably suppressed the enzyme activity. When NMN was used as substrate, Km and Vmaxof the enzyme were 16.89 mmol/L and 2.46 μmol/(L·min), respectively. The successful overexpression of NMN adenylyltransferase gene in E. coli could lay the foundation for application of NAD through biosynthesis method.

Key wordsEscherichia coli; NMN adenylyltransferase; cloning and expression; enzymatic properties

doi:10.3969/j.issn.1001-6678.2016.02.006

作者簡介：段琳琳(1990～)，女，碩士研究生。研究方向： 微生物資源綜合利用。E-mail: duanlinlin0303@163.com。 *通訊作者：李紅梅，博士，碩士生導(dǎo)師。Tel：021-55271117，E-mail:sunnysand@126.com。