結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞比例及功能

歐陽(yáng)書?！∴嵟d斌　梁金龍　謝　銘

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州　遵義　563000)

結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞比例及功能

歐陽(yáng)書睿鄭興斌梁金龍謝銘

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州遵義563000)

〔摘要〕目的觀察結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞數(shù)量和功能的改變。方法選取結(jié)直腸癌患者20例及同期入院進(jìn)行健康體檢者20例，抽取受試者清晨空腹外周血10 ml。采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其外周血Vδ1 T細(xì)胞及Vδ2 T細(xì)胞比例，并檢測(cè)Vδ1 T細(xì)胞表面Foxp3表達(dá)情況及Vδ2 T細(xì)胞穿孔素表達(dá)情況。結(jié)果結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞比例為(1.45±0.52)%，Vδ2 T細(xì)胞比例為(5.46±1.42)%；健康對(duì)照外周血Vδ1 T細(xì)胞比例為(2.62±0.89)%，Vδ2 T細(xì)胞比例為(0.93±0.34)%；與健康對(duì)照相比，結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01)，而Vδ2 T細(xì)胞比例顯著降低(P<0.01)。結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞Foxp3表達(dá)水平(2.45±1.32)%較健康對(duì)照(6.82±2.14)%相比顯著升高(P<0.01)。結(jié)直腸癌患者外周血Vδ2 T細(xì)胞穿孔素表達(dá)水平(32.73±11.74)%較健康對(duì)照(21.73±7.42)%相比顯著降低(P<0.01)。隨著結(jié)直腸癌患者病理分級(jí)的升高，結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞比例逐漸升高(P<0.01)；隨著病情嚴(yán)重性的增加，結(jié)直腸癌患者外周血Vδ2 T細(xì)胞比例逐漸降低(P<0.01)。結(jié)論結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞比例升高且免疫抑制作用增強(qiáng)，而Vδ2 T細(xì)胞比例降低且殺傷功能減弱，結(jié)直腸癌患者免疫功能的這種改變可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕結(jié)直腸癌；T細(xì)胞；免疫調(diào)節(jié)；穿孔素

盡管結(jié)直腸癌的診斷和治療手段目前都有顯著提高，然而手術(shù)和化療的療效仍然不能令人滿意〔1，2〕。δ T細(xì)胞僅占外周血CD3+T細(xì)胞的1%～10%〔3〕。人類δ T細(xì)胞主要分為兩大亞群，即Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞〔4，5〕。Vδ1 T細(xì)胞主要存在于上皮相關(guān)的淋巴組織，而Vδ2 T細(xì)胞主要存在于外周血中。Vδ1 T細(xì)胞主要功能為免疫調(diào)節(jié)作用〔6〕，而Vδ2 T細(xì)胞主要為腫瘤殺傷功能〔7〕。Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已有大量文獻(xiàn)報(bào)道〔8～10〕。但目前關(guān)于Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞數(shù)量和功能的改變?cè)诮Y(jié)直腸癌中的比例和功能研究很少有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)考察結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞比例和功能的變化，明確結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞比例和功能的變化與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1臨床資料選取2013 年10月30日至2014 年12月30日在我科住院的結(jié)直腸癌患者20例?；颊咝g(shù)前均未接受化學(xué)治療、放射治療或免疫治療。收集患者清晨空腹外周血，同時(shí)收集20例健康對(duì)照外周血作為對(duì)照。20例患者的平均年齡(58.35±11.52)歲，健康對(duì)照平均年齡(57.84±12.73)歲。所有結(jié)直腸癌患者均經(jīng)手術(shù)治療，并經(jīng)病理醫(yī)生評(píng)估患者的臨床病理分期。

1.2外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離方法抗凝血管無(wú)菌采集受試者的空腹外周血，抗凝血采用無(wú)菌PBS按1∶1的比例稀釋，隨后按2∶1的比例緩緩加入已預(yù)加淋巴細(xì)胞分離液的15 ml離心管中，800 r/min離心18 min；采用無(wú)菌滴管吸取淋巴細(xì)胞分離液上層的白膜層，加入裝有10 ml無(wú)菌PBS的15 ml離心管中，600 r/min離心15 min；細(xì)胞沉淀以10 ml無(wú)菌PBS重懸，400 r/min離心8 min；再用1 ml無(wú)菌PBS將細(xì)胞沉淀重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后制備成濃度為2×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。

1.3外周血Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞比例測(cè)定無(wú)菌分選獲取的PBMC，以含1%BSA 的PBS洗滌2次后，加入相應(yīng)熒光抗體(APC-CD3、FITC-TCR Vδ1，PE-TCR Vδ2)，4℃避光孵育30 min；以含1%BSA 的PBS洗滌兩次后，細(xì)胞重懸于0.1 ml 1%多聚甲醛固定液中待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4Vδ1 T細(xì)胞表面Foxp3表達(dá)檢測(cè)無(wú)菌分選獲取的PBMC，以含1%BSA 的PBS洗滌2次后，加入相應(yīng)熒光抗體(PE-CD3、FITC-TCR Vδ1)，4℃避光孵育30 min；以含1%BSA 的PBS洗滌2次后加入0.5 ml細(xì)胞膜固定透化液重懸細(xì)胞，室溫避光30 min；以透化液洗滌細(xì)胞2次后加入相應(yīng)熒光抗體(APC-Foxp3)，室溫避光30 min；以透化液洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞重懸于0.2 ml 1%多聚甲醛固定液中待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5Vδ2 T細(xì)胞穿孔素表達(dá)檢測(cè)無(wú)菌分選獲取的PBMC，以PMA和Ion預(yù)先刺激6 h，隨后采用上述1.4染色方法進(jìn)行Vδ2 T細(xì)胞穿孔素表達(dá)檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件。兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用ANOVA分析。

2結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞比例結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞比例為(1.45±0.52)%，顯著高于健康對(duì)照〔(2.62±0.89)%〕(P<0.01)；結(jié)直腸癌患者外周血Vδ2 T細(xì)胞比例為(5.46±1.42)%，顯著低于健康對(duì)照〔(0.93±0.34)%〕(P<0.01)。

2.2結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞Foxp3表達(dá)結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞Foxp3表達(dá)水平為(2.45±1.32)%，顯著高于健康對(duì)照〔(6.82±2.14)%〕(P<0.01)。

2.3結(jié)直腸癌患者外周血Vδ2 T細(xì)胞穿孔素表達(dá)結(jié)直腸癌患者外周血Vδ2 T細(xì)胞穿孔素表達(dá)水平為(32.73±11.74)%，顯著高于健康對(duì)照〔(21.73±7.42)%〕(P<0.01)。

2.4結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T、Vδ2 T細(xì)胞比例與臨床分期關(guān)系如圖1所示，隨著病情嚴(yán)重性的增加，結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞比例逐漸升高(P<0.01)，Vδ2 T細(xì)胞比例逐漸降低(P<0.01)。

1)P<0.05圖1　結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞比例與臨床分期關(guān)系

3討論

盡管結(jié)直腸癌的診斷和治療手段目前都有顯著提高，然而手術(shù)和化療的療效仍然不能令人滿意〔1〕。本研究證實(shí)結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞比例顯著升高，而Vδ2 T細(xì)胞比例顯著降低。人類δT細(xì)胞主要分為兩大亞群，即主要存在于上皮相關(guān)淋巴組織的Vδ1 T細(xì)胞和主要存在于外周血中的Vδ2 T細(xì)胞〔2，3〕。Vδ1 T細(xì)胞主要功能為免疫調(diào)節(jié)作用〔4〕，而Vδ2 T細(xì)胞主要為腫瘤殺傷功能〔5〕。本研究結(jié)果證實(shí)，結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用顯著增強(qiáng)。Vδ2 T細(xì)胞主要通過(guò)穿孔素-顆粒酶途徑殺傷腫瘤細(xì)胞〔6〕，本研究同時(shí)證實(shí)Vδ2 T細(xì)胞的腫瘤殺傷功能顯著降低。上述結(jié)果提示結(jié)直腸癌患者外周血免疫功能處于免疫抑制狀態(tài)，這種免疫抑制狀態(tài)可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，尤其是血液途徑的轉(zhuǎn)移。

δ T細(xì)胞主要以主要組織相容性復(fù)合體(MHC)非限制性方式識(shí)別多種腫瘤相關(guān)抗原〔7～9〕，并能分泌多種細(xì)胞因子〔10,11〕。因此，近年來(lái)δ T細(xì)胞已成為腫瘤過(guò)繼免疫治療的優(yōu)勢(shì)候選細(xì)胞〔12〕。在腫瘤患者化療后的適當(dāng)時(shí)機(jī)給予患者Vδ2 T細(xì)胞過(guò)繼免疫治療可增強(qiáng)患者的抗腫瘤免疫活性〔13〕。而與Vδ2 T細(xì)胞不同的是，Vδ1 T細(xì)胞主要表現(xiàn)為免疫抑制作用，腫瘤患者體內(nèi)表達(dá)水平升高的Vδ1 T細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔14〕。本研究明確了結(jié)直腸癌患者外周血Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞比例和功能的變化情況，為結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。

4參考文獻(xiàn)

1Quan Y,Xu M,Cui P,etal.Grainyhead-like 2 promotes tumor growth and is associated with poor prognosis in colorectal cancer〔J〕.J Cancer,2015;6(4):342-50.

2Hayday AC.〔gamma〕〔delta〕cells:a right time and a right place for a conserved third way of protection〔J〕.Ann Rev Immunol,2000;18:975-1026.

3Christmas SE.Subpopulations of human peripheral T gamma delta lymphocytes〔J〕.Immunol Today,1989;10(11):361.

4Li X,Kang N,Zhang X,etal.Generation of human regulatory gammadelta T cells by TCRgammadelta stimulation in the presence of TGF-beta and their involvement in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus〔J〕.J Immunol,2011;186(12):6693-700.

5Accardo-Palumbo A,Giardina AR,Ciccia F,etal.Phenotype and functional changes of Vgamma9/Vdelta2 T lymphocytes in Behcet′s disease and the effect of infliximab on Vgamma9/Vdelta2 T cell expansion,activation and cytotoxicity〔J〕.Arthritis Res Ther,2010;12(3):R109.

6Yin S,Zhang J,Mao Y,etal.Vav1-phospholipase C-γ1(Vav1-PLC-γ1)pathway initiated by T cell antigen receptor(TCRγδ)activation is required to overcome inhibition by ubiquitin ligase Cb1-b during γδT cell cytotoxicity〔J〕.J Biol Chem,2013；288(37):26448-62.

7Moser B,Eberl M.Gammadelta T cells:novel initiators of adaptive immunity〔J〕.Immunol Rev,2007;215:89-102.

8Kabelitz D,Wesch D,He W.Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology〔J〕.Cancer Res,2007;67(1):5-8.

9Morita CT,Mariuzza RA,Brenner MB.Antigen recognition by human gamma delta T cells:pattern recognition by the adaptive immune system〔J〕.Springer Semin Immunopathol,2000;22(3):191-217.

10盧益中，江松平，徐建歐.腦心通膠囊合天麻鉤藤飲顆粒序貫治療中風(fēng)后眩暈癥的臨床體會(huì)〔J〕.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2014；33(25)：7-8.

11鄭萬(wàn)利.自擬止眩湯治療老年人眩暈40例〔J〕.陜西中醫(yī),2013；34(2):173-4.

12周曉玲，謝勝，殷小蘭.中醫(yī)辨證論治結(jié)合拉米夫定治療慢性乙型肝炎臨床療效觀察〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2010；20(2)：80-2.

13Mattarollo SR,Kenna T,Nieda M,etal.Chemotherapy and zoledronate sensitize solid tumour cells to Vgamma9Vdelta2 T cell cytotoxicity〔J〕.Cancer Immunol Immunother,2007;56(8):1285-97.

14Peng G,Wang HY,Peng W,etal.Tumor-infiltrating gammadelta T cells suppress T and dendritic cell function via mechanisms controlled by a unique toll-like receptor signaling pathway〔J〕.Immunity,2007;27(2):334-48.

〔2015-11-19修回〕

(編輯徐杰)

通訊作者：謝銘(1967-)，女，主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤研究。

〔中圖分類號(hào)〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)11-2597-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.012

第一作者：歐陽(yáng)書睿(1987-)，男，博士，醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤研究。