玉屏風(fēng)口服液抑制小鼠前列腺癌皮下移植瘤的免疫學(xué)機(jī)制

隋　欣　賈　瓊　李　輝　黃連弟　李俊瑋　黃歆梅　曹　琛　李　娜　粟　栗

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林　長春　130017)

玉屏風(fēng)口服液抑制小鼠前列腺癌皮下移植瘤的免疫學(xué)機(jī)制

隋欣賈瓊李輝1黃連弟2李俊瑋2黃歆梅2曹琛2李娜粟栗

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130017)

〔摘要〕目的探討玉屏風(fēng)口服液對小鼠前列腺癌皮下移植瘤的抑制作用及其免疫學(xué)機(jī)制。 方法將體外培養(yǎng)的小鼠前列腺癌RM1細(xì)胞接種于C57B/L小鼠皮下，構(gòu)建小鼠前列腺癌皮下移植瘤模型，荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組，分別灌胃給予玉屏風(fēng)口服液0、0.5、1和2 ml，1次/d，共28 d，末次給藥的第2天眼球取血處死小鼠，取瘤測瘤體積，蘇木素-伊紅(HE)染色檢測組織學(xué)變化，取脾細(xì)胞檢測淋巴細(xì)胞增殖能力和自然殺傷(NK)細(xì)胞殺傷活性，ELISA方法檢測血清中白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、干擾素(IFN)-γ及腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。 結(jié)果玉屏風(fēng)口服液處理后，小鼠前列腺癌皮下移植瘤體積縮小，腫瘤組織出現(xiàn)壞死及炎細(xì)胞浸潤，淋巴細(xì)胞增殖能力和NK細(xì)胞殺傷活性增強(qiáng)，血清中IL-2、IFN-γ及TNF-α含量增加。 結(jié)論玉屏風(fēng)口服液可抑制小鼠前列腺癌皮下移植瘤的生長，其抑瘤作用與增強(qiáng)小鼠免疫功能有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕玉屏風(fēng)口服液；前列腺癌；抑瘤作用；免疫調(diào)節(jié)

前列腺癌患者以中晚期病例為主，失去了根治手術(shù)的機(jī)會，同時化療、放療效果不佳。玉屏風(fēng)是扶正固表的經(jīng)典方劑，由黃芪、白術(shù)和防風(fēng)三味中藥組成，具有益氣、固表、止汗之功效，主要用于自汗惡風(fēng)、表虛不固、體虛易感風(fēng)邪者。臨床適應(yīng)證多與免疫力低下或變態(tài)反應(yīng)有關(guān)，不僅可用于治療各種免疫性疾病如腎炎、蕁麻疹、過敏性鼻炎等，還可用于腫瘤輔助治療，改善病人的生活質(zhì)量〔1～5〕，但玉屏風(fēng)對前列腺癌的作用尚未報道。本研究旨在探討玉屏風(fēng)口服液對前列腺癌皮下移植瘤的抑制作用及其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑小鼠前列腺癌RM1細(xì)胞購自ATCC，RPMI 1640及胎牛血清購自美國Hyclone公司，C57B/L小鼠購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，ELISA試劑盒購自美國RND公司，Con A、MTT為美國sigma公司產(chǎn)品，玉屏風(fēng)口服液為江西南昌濟(jì)生制藥廠產(chǎn)品，兔抗CD3、CD4、CD8單克隆抗體及HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自美國protein tech公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)復(fù)蘇RM1細(xì)胞，將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞生長達(dá)80%融合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3分組與給藥將40只C57雄性小鼠隨機(jī)分為空白對照組、玉屏風(fēng)口服液高劑量組(2.0 ml/kg)組、玉屏風(fēng)中劑量組(1.0 ml/kg)和玉屏風(fēng)低劑量組(0.5 ml/kg)，每組10只。預(yù)給藥1 w后調(diào)整RM1細(xì)胞濃度為1×107個/ml，接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，每只200 μl，繼續(xù)每日灌胃給藥28 d，麻醉狀態(tài)下眼球取血并分離血清，無菌條件下取出脾臟及瘤組織，將瘤組織稱重并計算抑瘤率。

1.4脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力測定參考文獻(xiàn)方法〔6,7〕，無菌取大鼠脾臟，以含10%胎牛血清的RPMI l640完全培養(yǎng)液吹打出單細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min。棄上清后加紅細(xì)胞裂解液2 ml，在冰上裂解2 min，再加入培養(yǎng)基至10 ml，1 200 r/min離心5 min。離心后洗滌2次，棄上清，用1 ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活力>95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/ml，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。刺激孔加入ConA至終濃度20 μg/ml，設(shè)6個重復(fù)孔。細(xì)胞置37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h。每孔加5 mg/ml MTT溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。每孔加 DMSO 150 μl，震蕩10 min，490 nm處讀取OD值，計算刺激指數(shù)(SI)：實(shí)驗(yàn)組的平均OD值/對照組的平均OD值。

1.5自然殺傷(NK)細(xì)胞殺傷活性檢測消化懸浮對數(shù)生長期RM1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/ml。調(diào)整脾細(xì)胞濃度為5×106個/ml。96孔培養(yǎng)板中先后加入RM1細(xì)胞懸液和脾細(xì)胞懸液各100 μl。設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對照孔和靶細(xì)胞對照孔：其中效應(yīng)細(xì)胞對照孔加脾細(xì)胞和1640培養(yǎng)液各100 μl；靶細(xì)胞對照孔加RM1細(xì)胞和1640培養(yǎng)液各100 μl。每個樣本做6個復(fù)孔。37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT 10 μl，繼續(xù)孵育4 h。吸棄上清后每孔加150 μl DMSO，酶標(biāo)儀測定490 nm處的OD值，NK細(xì)胞活性(%)=〔1-(ODE+T-ODE)/ODT〕×100%(ODE：效應(yīng)細(xì)胞孔的OD值；ODE+T：效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞的OD值；ODT：靶細(xì)胞孔的OD值)。

1.6ELISA方法檢測細(xì)胞因子血清白細(xì)胞介素(IL)-2，IL-4，干擾素(IFN)-γ，腫瘤壞死因子(TFN)-α水平檢測按照ELISA試劑盒使用說明書進(jìn)行。將樣品稀釋液40 μl及樣品10 μl加入酶標(biāo)板孔底部，混勻后37℃溫育30 min，洗滌5次，拍干；每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，37℃溫育30 min，洗滌5次，拍干；加入顯色劑，37℃避光顯色10 min，加入終止液，于450 nm處檢測各孔OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程計算樣品細(xì)胞因子含量。

1.7蘇木素-伊紅(HE)染色腫瘤組織用4%的多聚甲醛固定石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。二甲苯脫蠟后常規(guī)HE染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明后樹膠封片置于，顯微鏡下觀察。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1移植瘤組織體積給予玉屏風(fēng)口服液灌胃后，前列腺癌皮下移植瘤生長速度變緩，腫瘤體積減小，其中以中劑量和高劑量組移植瘤體積減小最為明顯。

2.2HE染色與對照組相比，治療組可見較多死亡細(xì)胞，表現(xiàn)為核固縮、碎裂或崩解，并出現(xiàn)較多細(xì)胞碎片，組織結(jié)構(gòu)消失呈均質(zhì)紅染等形態(tài)學(xué)改變，伴有淋巴細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.3淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對照組相比，玉屏風(fēng)口服液高劑量組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)，NK細(xì)胞的活性明顯增強(qiáng)(P<0.05)。見表1。

2.4細(xì)胞因子的檢測結(jié)果與對照組相比，玉屏風(fēng)口服液高劑量組小鼠血清中IL-2、TNF-α明顯升高(P<0.05)，中劑量組及高劑量組小鼠血清中IFN-γ顯著升高(P<0.01)。見表1。

A：對照組；B：低劑量組；C：中劑量組；D：高劑量組圖1　玉屏風(fēng)口服液對前列腺癌皮下移植瘤組織學(xué)的影響(HE)

組別SINK細(xì)胞活性(%)IL-2(ng/L)IL-4(pg/ml)IFN-γ(ng/L)TNF-α(ng/L)對照組1.05±0.0273.64±2.93162.85±24.6012.24±1.4984.92±7.7119.95±0.52低劑量組1.08±0.1380.56±8.09188.61±19.4211.12±0.52114.9±30.9020.80±1.53中劑量組1.18±0.061)86.80±8.251)197.70±18.4611.89±0.97134.92±3.401)20.46±0.80高劑量組1.26±0.081)87.13±7.411)214.67±49.211)11.01±0.38155.75±7.631)21.48±0.261)

與對照組比較：1)P<0.05

3討論

近年來前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害老年男性健康。前列腺癌早期可采用激素療法和手術(shù)切除治療，晚期則主要依靠化療。由于前列腺癌早期無明顯臨床癥狀，一旦發(fā)現(xiàn)則往往已屬晚期。目前治療前列腺癌的化療藥物價格昂貴且存在較大毒副作用，而中藥則可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫輔助治療腫瘤。

中醫(yī)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與正虛邪實(shí)關(guān)系密切，邪實(shí)既指感受邪氣，又指體內(nèi)邪氣過盛，無論外感六淫，內(nèi)傷七情，還是飲食勞傷，皆可導(dǎo)致機(jī)體臟腑功能失調(diào)，陰陽失和，七血紊亂，或?yàn)樘的?，或?yàn)檠?。而淤血、痰塊作為致病因素，在正虛的條件下，內(nèi)外合邪，毒邪留滯，致發(fā)腫瘤。因此關(guān)于腫瘤的治療多采用扶正結(jié)合祛邪，增強(qiáng)后天功能和機(jī)體免疫力是當(dāng)前常用的惡性腫瘤治療法則，可有效改善患者生活質(zhì)量、延長帶瘤生存期。玉屏風(fēng)是扶正固表的良方，玉屏風(fēng)口服液對前列腺癌皮下移植瘤有明顯的抑瘤作用，免疫學(xué)機(jī)制可能參與玉屏風(fēng)的抑瘤作用。NK細(xì)胞是機(jī)體免疫功能的重要執(zhí)行細(xì)胞，可殺傷某些腫瘤或受病毒感染的細(xì)胞，為機(jī)體抗腫瘤的第一道防線。T淋巴細(xì)胞是參與獲得性免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞之一，它主要在胸腺內(nèi)分化成熟，到達(dá)外周免疫器官后發(fā)揮細(xì)胞和體液免疫調(diào)節(jié)作用。本研究表明玉屏風(fēng)口服液可激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。NK細(xì)胞的殺傷作用具有非特異性，可通過其受體識別靶細(xì)胞配體直接殺傷靶細(xì)胞或通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用直接殺傷靶細(xì)胞，NK細(xì)胞的這些免疫效應(yīng)在抗腫瘤免疫作用中具有非常重要的地位。NK細(xì)胞還可分泌TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，同時增加自身的抗腫瘤免疫效應(yīng)。本研究中玉屏風(fēng)口服液處理組TNF-α和IFN-γ顯著增高，可能是由于NK細(xì)胞活化后，導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌增加的結(jié)果。本研究結(jié)果提示，惡性腫瘤引起的宿主自身免疫抑制是治療腫瘤的有效靶點(diǎn)，應(yīng)用藥物增強(qiáng)免疫是抗腫瘤的有效方式。

4參考文獻(xiàn)

1高銳卿，苗相本.玉屏風(fēng)散在呼吸系統(tǒng)疾病中的藥理及臨床研究進(jìn)展〔J〕.浙江中醫(yī)雜志，2003；(7):318-9.

2周若梅，李來秀.玉屏風(fēng)口服液的藥理學(xué)研究〔J〕.陜西中醫(yī)，2004；25(1):71-3.

3辛洪濤，侯林江，徐少華，等.玉屏風(fēng)散的免疫藥理研究進(jìn)展〔J〕.中國中藥雜志，1998；23(8):505-7.

4侯林江，辛洪濤.玉屏風(fēng)散的免疫藥理研究進(jìn)展〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1998；18(11):701-3.

5陳向濤，李俊.玉屏風(fēng)散的免疫藥理研究進(jìn)展〔J〕.安徽醫(yī)藥，2003；7(4):241-3.

6Thomasset DN.Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation〔J〕.J Immunol Methods,1986；94(1-2):57-63.

7Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays〔J〕.J Immunol Methods,1983；65(1-2):55-63.

〔2015-12-12修回〕

(編輯滕欣航)

基金項(xiàng)目：吉林省教育廳科研基金資助課題(吉教科合字〔2015〕第342號)；吉林省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(2012Z024)

通訊作者：李娜(1978-)，女，副研究員，主要從事藥理學(xué)研究。

〔中圖分類號〕R258.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2611-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.019

1吉林省前衛(wèi)醫(yī)院2吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部

粟栗(1974-)，女，副教授，主要從事膏方劑學(xué)研究。

第一作者：隋欣(1984-)，女，博士在讀，講師，主要從事中藥藥劑學(xué)研究。