組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9在老年女性壓力性尿失禁患者陰道壁中的表達及意義

呂　順　陳　雋　馮化杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9在老年女性壓力性尿失禁患者陰道壁中的表達及意義

呂順1陳雋2馮化杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006)

〔摘要〕目的觀察組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-1和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9在女性壓力性尿失禁(SUI)患者陰道壁中的表達情況及其機制。方法隨機選取25例SUI患者作為觀察組，25例盆底器官脫垂癥(POP)患者作為脫垂組，25例婦科良性疾病患者作為對照組。取所有受試者陰道壁結(jié)締組織制成切片，采用免疫組織化學(xué)法對切片進行染色，采用RT-PCR法檢測所有組織中TIMP-1和MMP-9 mRNA的表達情況。結(jié)果觀察組和脫垂組TIMP-1、MMP-9蛋白的表達及TIMP-1、MMP-9 mRNA ΔCt值差異顯著(P>0.05)，對照組TIMP-1蛋白表達顯著高于觀察組和脫垂組，而MMP-9蛋白表達顯著低于觀察組和脫垂組(P<0.05)。結(jié)論在SUI和POP患者的陰道壁組織中，MMP-9呈現(xiàn)高表達，TIMP-1呈現(xiàn)低表達，二者可能參與了SUI和POP的發(fā)病過程。

〔關(guān)鍵詞〕壓力性尿失禁；組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

盆底功能障礙性疾病(PFD)簡稱盆底疾病，主要包括壓力性尿失禁(SUI)和盆腔器官脫垂(POP)。目前對于PFD的發(fā)病機制尚未探明。有研究發(fā)現(xiàn)，SUI的患者常常伴發(fā)POP，故推測二者在發(fā)病機制上可能存在相似性〔1〕。目前研究認為，盆底韌帶和筋膜組織的降解可能是導(dǎo)致PFD的原因之一〔2〕。基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是一類蛋白酶，對細胞外基質(zhì)具有降解功能。而組織型基質(zhì)蛋白酶抑制劑(TIMPs)被發(fā)現(xiàn)具有抑制MMPs活性的作用。本研究探討TIMP-1和MMP-9在老年女性SUI患者陰道壁中的表達情況。

1材料與方法

1.1一般資料隨機選取2014年6～12月我院婦科收治確診為SUI并擬行TVT或TVT-O手術(shù)的患者25例作為觀察組，年齡51～63歲，平均(56.9±6.6)歲，平均產(chǎn)次(2.04±0.56)次；另選25例確診為POP患者為脫垂組，年齡51～61歲，平均(54.2±5.3)歲，平均產(chǎn)次(1.92±0.63)次；25例擬行手術(shù)治療的婦科良性疾病作為對照組，其中子宮肌瘤者18例，宮頸上皮內(nèi)瘤變7例，年齡51～61歲，平均(55.3±7.4)歲，平均產(chǎn)次(2.11±0.41)次。三組平均年齡和平均產(chǎn)次等一般臨床資料無顯著差異(P>0.05)。

1.2入選標(biāo)準(zhǔn)〔3〕①所有患者近6個月內(nèi)未使用過雌激素藥物；②無盆底組織手術(shù)史；③全身各處無基地組織??；④無生殖道感染性疾病；⑤脫垂組患者未合并SUI。觀察組患者入選標(biāo)準(zhǔn)：① 尿常規(guī)正常，尿培養(yǎng)陰性；② 神經(jīng)系統(tǒng)功能正常；③ 膀胱內(nèi)壓、容量、感覺均正常；④參與尿量正常；⑤ 不存在非自主逼尿肌收縮。排除卵巢功能性腫瘤者、肺纖維化者、肝硬化者、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎者。

1.3實驗方法本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書，均于手術(shù)中在陰道正上方取大小為0.1 cm×0.3 cm×0.3 cm陰道壁組織各兩塊，用0.9%NaCl將血液沖凈，一塊置于10%甲醛(中性)中保存，一塊置于Ep管中，并置于液氮中保存。

1.3.1免疫組織化學(xué)(S-P)法染色將甲醛中的組織塊取出，常規(guī)石蠟包埋，每例標(biāo)本切成厚3 μm的切片3片，采用S-P法對切片進行TIMP-1和MMP-9的檢測。選用兔抗人TIMP-1單克隆抗體和鼠抗人MMP-9單克隆抗體(均購自上海研晶生物科技有限公司)，陰性標(biāo)本采用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為一抗。SP試劑盒與DAB顯色劑均購自北京北瑞達醫(yī)藥科技有限公司。所有操作均嚴(yán)格按照試劑或試劑盒相應(yīng)說明書操作。10×40倍鏡下，選取4個互不重疊的視野觀察。用Image pro plus 4.0計算染色顆粒的累積光密度值(IOD)，其IOD與染色程度呈正比。

1.3.2RT-PCR法檢測RNA將液氮中的組織塊取出，在4℃環(huán)境中將組織切成小塊，研磨、離心后用Trizol裂解液將組織中總RNA提取。用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶與隨機引物進行RT-PCR(5333，Eppendorf)，合成cDNA，反應(yīng)體系：Buffer 5 μl、dNTP 1.25 μl、RNA酶抑制劑0.65 μl、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl、oligo-dT 1 μl，mRNA 1 μl、DEPC蒸餾水10.1 μl。逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃下60 min，95℃下5 min。然后利用熒光定量PCR，檢測TIMP-1 mRNA和MMP-9 mRNA相對含量，TIMP-1 mRNA序列：5′-TTCCACAGGTCCCACAACCGCAGC,3′-CGTCCACAAGCAATGAGT,片段長度228 dp；MMP-9序列：5′TGTGGCAGCACCAGGGCAGC GTGGGAGCCAGGGCC，3′-GCCTGCCACTTCCCCTTCATC,長度473 dp，反應(yīng)體系：SYDR Green 8 μl、plus 2 μl、上游引物、下游引物各1.2 μl、去RNA酶6.6 μl、cDNA 1 μl，擴增條件：94℃下30 s，45℃下30 s，72℃下60 s，進行40個循環(huán)，后72℃下300 s。將PCR產(chǎn)物進行3%瓊脂凝膠電泳，EB染色后置于紫外燈下觀察。根據(jù)RT-PCR曲線計算其△Ct值。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗、單因素方差分析和Spearmon相關(guān)性檢驗。

2結(jié)果

2.1TIMP-1、MMP-9在組織中的染色情況TIMP-1和MMP-9均主要在結(jié)締組織細胞的細胞質(zhì)內(nèi)表達，均為淡黃色至棕黃色顆粒，見圖1，圖2。

圖1　TIMP的表達情況(10×40)

圖2　MMP-9的表達情況(10×40)

2.2各組TIMP-1和MMP-9的表達情況三組TIMP-1、MMP-9蛋白表達差異顯著(P<0.05)，觀察組和脫垂組無顯著差異(P>0.05)，對照組TIMP-1蛋白表達顯著高于觀察組和脫垂組，而MMP-9蛋白表達顯著低于觀察組和脫垂組(P<0.05)，見表1。

2.3PCR產(chǎn)物觀察電泳結(jié)果各目的基因在各組中的表達，見圖3。

2.4三組患者TIMP-1和MMP-9 mRNA△Ct值結(jié)果三組TIMP-1、MMP-9 mRNA△Ct值差異顯著(P<0.05)，觀察組和脫垂組間無顯著差異(P>0.05)，對照組TIMP-1 mRNAΔCt值顯著高于觀察組和脫垂組，而MMP-9 mRNAΔCt值顯著低于觀察組和脫垂組(P<0.05)，見表2。

表1　各組TIMP-1和MMP-9的

與對照組比較：1)P<0.05；下表同

1、3、5條帶分別為觀察組、脫垂組和對照組的TIMP-1；2、4、6條帶分別為觀察組、脫垂組和對照組的MMP-9圖3　TIMP-1和MMP-9 mRNA電泳結(jié)果

組別TIMP-1MMP-9觀察組1.996±0.2641)16.241±0.7111)脫垂組1.908±0.4131)15.982±0.6491)對照組3.682±0.44910.124±0.816

2.5TIMP-1和MMP-9在SUI中表達相關(guān)性TIMP-1與MMP-9的表達呈負相關(guān)(r=-0.916，P<0.001)。

3討論

SUI是由多種致病因素相互作用導(dǎo)致的，年齡、妊娠與分娩情況、體內(nèi)雌激素水平都是造成SUI的原因，但對于SUI的發(fā)病機制尚不明了，目前大部分學(xué)者贊同盆底支持結(jié)構(gòu)的薄弱化與SUI密切相關(guān)〔4，5〕。而盆底的支持主要來自肌肉、韌帶和筋膜，而連接膠原、彈性硬蛋白、網(wǎng)硬蛋白的細胞外基質(zhì)(ECM)是在這些組織中起到十分重要的作用。

近年來，MMPs和TIMPs在SUI發(fā)病中的作用逐漸受到重視，并被認為是導(dǎo)致SUI的重要機制之一。MMP-9是一種明膠酶，可以將明膠水解，當(dāng)盆底筋膜組織中MMP-9存在過表達時，對筋膜中Ⅰ型和Ⅲ型膠原大量降解，從而減弱了筋膜的支持作用〔6〕。本研究結(jié)果與劉穎琳等〔5〕的研究結(jié)果一致，提示MMP-9在SUI和POP患者的陰道壁組織中表達增強，MMP-9可能參與了SUI和POP的發(fā)病。結(jié)合本次研究結(jié)果可以推測，SUI和POP的共同發(fā)病機制使MMP-9的過量表達，而導(dǎo)致陰道壁的Ⅰ型和Ⅲ型膠原大量降解，減弱了其支持功能造成的。本研究還提示由于陰道壁組織細胞內(nèi)MMP-9基因的活化造成了MMP-9的過表達。

目前已探明的人體內(nèi)對于MMPs具有抑制作用的主要有兩大類：一類為血源性，即纖溶酶原激活劑抑制物；另一類為組織源性，即TIMPs。TIMPs是人體內(nèi)對MMPs起到監(jiān)管作用，目前已知的TIMPs有TIMP1～4。馬雙玲等〔6〕發(fā)現(xiàn)TIMP-1和TIMP-2具有較強的對MMPs的抑制作用，幾乎可以抑制目前所有已發(fā)現(xiàn)的MMPs活性。本研究結(jié)果與Choi等〔7〕的研究結(jié)果一致，這提示TIMP-1在SUI和POP患者的陰道壁組織中表達降低，而結(jié)合前面的結(jié)果，可以推測，是由于TIMP-1的表達降低，導(dǎo)致TIMP-1和MMP-9之間的平衡被打破，導(dǎo)致膠原降解增強。曾有學(xué)者認為SUI是由于盆底結(jié)締組織中成纖維細胞合成和分泌膠原蛋白的能力下降所致，但本次研究結(jié)果說明SUI和POP是由于膠原降解過多所致〔8〕。本次研究還提示SUI和POP患者陰道壁組織中TIMP-1的基因被抑制，從而造成TIMP-1的表達減少，但具體機制仍需要進一步研究。

綜上，在老年SUI和POP患者的陰道壁組織中，MMP-9呈現(xiàn)高表達，TIMP-1呈現(xiàn)低表達，二者可能參與了SUI和POP的發(fā)病過程。

4參考文獻

1Li GY，Cui WS，Zhou F,etal.Pathology of urethral fibromuscular system related to parturition-induced stress urinary incontinence and TGF-β1/Smad pathway〔J〕.Mol Cell Biochem，2012;364(1/2)：329-35.

2Kim IG，Piao S，Hong S,etal.The effect of a bioactive tissue-engineered sling in a rat of stress incontinence model〔J〕.J Biomed Mater Res A，2012;100A(2)：286-92.

3Mostafa A，Lim CP，Hopper L,etal.Single-incision mini-slings versus standard midurethral slings in surgical management of female stress urinary incontinence：An updated systematic review and meta-analysis of effectiveness and complications〔J〕.Eur Urol，2014;65(2)：402-27.

4Kim JH，Shin SH，Oh MM,etal.Factors affecting transient urinary retention after transobturator tape mid-urethral sling surgery for female patients with stress urinary incontinence：A single center experience〔J〕.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2013;168(1)：107-11.

5劉穎琳，譚玉清，丁紅，等.水中待產(chǎn)產(chǎn)婦盆底組織MMP-1、TIMP-1的表達及臨床意義〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2013;34(4)：568-73.

6馬雙玲，王魯文，馬學(xué)玲，等.TGF-β1/CTGF信號傳導(dǎo)通路在女性壓力性尿失禁發(fā)生中的研究〔J〕.中國婦幼保健，2014;29(11)：1763-6.

7Choi SJ，Oh SH，Kim IG,etal.Functional recovery of urethra by plasmid DNA-loaded injectable agent for the treatment of urinary incontinence〔J〕.Biomaterials，2013;34(20)：4766-76.

8Jiang YH，Wang CC，Chuang FC,etal.Positioning of a suburethral sling at the bladder neck is associated with a higher recurrence rate of stress urinary incontinence〔J〕.J Ultrasound Med，2013;32(2)：239-45.

〔2015-10-20修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

基金項目：黑龍江省衛(wèi)生廳科研基金資助(No.2014-278)

通訊作者：陳雋(1975-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科疾病研究。

〔中圖分類號〕R694+.54

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2723-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.072

1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院

2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院微形態(tài)實驗中心

第一作者：呂順(1993-)，男，主要從事麻醉及泌尿外控研究。