減毒單增李斯特菌疫苗遞呈研究進(jìn)展①

丁承超　陳國薇　吳　嫚　劉武康　劉　箐

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093)

·專題綜述·

減毒單增李斯特菌疫苗遞呈研究進(jìn)展①

丁承超陳國薇吳嫚劉武康劉箐

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093)

單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一種革蘭氏陽性兼性厭氧胞內(nèi)寄生條件致病菌。該菌可穿越腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障,引起人和動物的胃腸炎、腦膜炎、敗血癥[1]。且具有獨(dú)有的胞內(nèi)逃逸存活和胞間傳送等特性，因此是研究胞內(nèi)寄生的模式細(xì)菌。目前研究發(fā)現(xiàn)Lm的毒力主要由六個毒力因子編碼基因(prfA-plcA-hly-mpl-actA-plcB)組成。plcA和plcB分別編碼磷脂酰肌醇特異性磷脂酶(PI-PLC)和卵磷脂酶(PC-PLC)，有助于Lm逃離吞噬小體；actA與基于Lm肌動蛋白的運(yùn)動性有關(guān)；hly則與Lm的溶血素有關(guān)，參與單增李斯特菌一級和次級吞噬小體的逃離；prfA主要調(diào)控Lm的侵襲相關(guān)毒力因子，如inlA和inlB等；mpl是一個依賴鋅的金屬蛋白酶基因[2，3]。以“Listeriamonocytogenes+vaccine”為關(guān)鍵詞在Medline進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn)，截至(2015/05/06)為止，共有703篇關(guān)于Lm作為疫苗載體的研究，其中近五年相關(guān)研究為301篇。這些研究表明，Lm能夠同時引起MHCⅠ和MHCⅡ類抗原遞呈系統(tǒng)，具有顯著激發(fā)強(qiáng)烈的CD8+和CD4+細(xì)胞免疫的能力。同時，減毒Lm作為口服疫苗載體可以調(diào)動機(jī)體的黏膜免疫效應(yīng)[4]。近年來隨著對單增李斯特菌毒力基因、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究的不斷深入，以及平衡致死載體和細(xì)菌表面展示等技術(shù)的快速發(fā)展，進(jìn)一步證明了減毒單增李斯特菌作為高效遞呈抗原活載體的實(shí)用價值。迄今為止減毒Lm活載體疫苗已成功應(yīng)用于人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)、人類乳頭瘤病毒(Human papillomavirus HPV)和轉(zhuǎn)移性胰腺癌等[5-7]人類復(fù)雜疾病的免疫治療中。

1減毒Lm的免疫機(jī)理及途徑

單增李斯特菌具有典型的胞內(nèi)寄生和胞間傳遞等特性，減毒后作為疫苗載體，能夠同時引起MHCⅠ和MHCⅡ抗原遞呈系統(tǒng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此單增李斯特菌已成為最重要的減毒活載體疫苗載體之一。減毒Lm作為疫苗載體有兩條抗原遞呈系統(tǒng)[8,9](如圖1所示)，其一是交叉遞呈途徑(Cross-presentation pathways)，即Lm被宿主吞噬細(xì)胞等細(xì)胞捕獲并降解后，細(xì)菌多肽被樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)通過細(xì)胞受體、內(nèi)吞等作用攝入細(xì)胞內(nèi)，再經(jīng)MHCⅠ和MHCⅡ兩條途徑分別遞呈給CD8+和CD4+T細(xì)胞；另外一條是傳統(tǒng)的遞呈途徑(Classical pathways),即Lm進(jìn)入細(xì)胞后，絕大部分Lm被溶酶體所包裹降解，降解的抗原通過MHCⅡ遞呈給CD4+T細(xì)胞，另外有5%～10%的Lm可通過其特有的毒力蛋白LLO降解溶酶體膜后逃逸，逃逸出來的細(xì)菌分泌的蛋白被蛋白酶體降解加工后通過MHCⅠ遞呈給CD8+T細(xì)胞。Lm從噬菌體的逃逸能力為其獨(dú)有，逃逸的Lm在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)抗原基因?qū)乖f呈至關(guān)重要，也是其作為減毒載體的最大優(yōu)勢。

圖1　Lm抗原遞呈途徑[9]Fig.1　Vaccine delivery of Lm[9]

2減毒Lm作為疫苗載體的優(yōu)勢

1990年，Wolff等[10]將裸露的脫氧核糖核酸注射給小鼠能引起外源基因的長期表達(dá)，由此誕生了脫氧核糖核酸免疫技術(shù)，使得DNA疫苗成為繼減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗和重組多肽疫苗之后的又一新型疫苗，被譽(yù)為第三次疫苗革命。在此后的20多年間，由此引發(fā)的DNA疫苗、基因工程疫苗等研究成為疫苗研究的熱點(diǎn)。在實(shí)際運(yùn)用中發(fā)現(xiàn)，這種裸露的DNA極易受到環(huán)境及宿主的降解，如何能將這些抗原基因在有保護(hù)的狀態(tài)下遞送給免疫對象成為疫苗開發(fā)必須解決的問題。細(xì)菌、病毒等微生物本身具有入侵并啟動宿主免疫系統(tǒng)的原始本能，早在一個世紀(jì)以前,紐約大夫Coley[11]驚訝地發(fā)現(xiàn)將滅活的革蘭氏陽性菌或陰性菌注射進(jìn)入腫瘤組織后腫瘤出現(xiàn)消退現(xiàn)象。這是第一次將細(xì)菌用于腫瘤控制的“原始疫苗載體”。此后有大量研究顯示，微生物疫苗載體在腫瘤控制中有良好的靶向性和控制力,甚至發(fā)現(xiàn)某些病原微生物似乎對腫瘤組織有一定的“偏好”[12]。因此，經(jīng)過毒力基因的減毒，攜帶靶標(biāo)抗原的減毒活載體疫苗迅速成為新型疫苗研究的熱點(diǎn)。

迄今為止，已開發(fā)的減毒疫苗微生物載體包括細(xì)菌，如沙門氏菌(Salmonella)、單增李斯特菌、乳酸桿菌(Lactobacilli)等，病毒如腺病毒、皰疹病毒，真菌如釀酒酵母等，與其他疫苗載體或者佐劑相比，微生物載體具有以下優(yōu)勢:①部分病原微生物偏好入侵抗原提呈細(xì)胞比如樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)，抗原遞呈效果好；②可穿透腸道屏障通過血液循環(huán)遠(yuǎn)程遞呈抗原；③抗原性良好，可刺激機(jī)體先天性和獲得性免疫系統(tǒng)；④可攜帶多個抗原研發(fā)多價疫苗；⑤能穿透腸道屏障進(jìn)入血液的疫苗載體，是口服式疫苗研發(fā)的最佳選擇[13]。但值得注意的是，雖然微生物減毒疫苗載體一出現(xiàn)，就表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢和良好的應(yīng)用前景，但其自身毒力基因的潛在安全性、對宿主基因表達(dá)的負(fù)面影響等也引起人們的關(guān)注。而與其他微生物疫苗載體如沙門氏菌相比，Lm存在明顯的優(yōu)勢：①對環(huán)境耐受性強(qiáng)，可在較高的鹽濃度(可高達(dá)40%NaCl)以及寬泛的pH(pH3～12)和溫度范圍(0～45℃)內(nèi)生長，VazquezBoland等[14]研究發(fā)現(xiàn)Lm在16～30℃下，均可入侵魚類細(xì)胞但30℃入侵最多，這種超強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力拓寬了Lm載體疫苗的使用范圍；②抗原遞呈增強(qiáng)能力，Lm表面的脂胞壁酸質(zhì)、肽聚糖、載脂蛋白等可與DC表面特異性Toll樣受體結(jié)合，DC在識別這些抗原后可以通過調(diào)節(jié)CD80、CD86、MHCⅡ類分子及炎性分子如IL-12、TNF-α起到加強(qiáng)抗原提呈作用[15]；③較好的安全性，減毒后的Lm其毒性下降明顯，如使hly基因發(fā)生突變，可使其毒力水平下降105數(shù)量級，敲除actA基因可使其毒力下降104數(shù)量級[16]。目前，以actA/plcB、actA/inlB、hly、prfA、actA等單個或者多個毒力基因敲除減毒的Lm已成功應(yīng)用于腫瘤、病毒等DNA疫苗載體中，部分疫苗已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期、Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)；④多種抗原遞呈能力，2006年，Loeffler等[17]發(fā)現(xiàn)減毒Lm不僅可以運(yùn)送抗原蛋白，而且可以運(yùn)送DNA和RNA，這種多種抗原的遞呈能力為疫苗的免疫保護(hù)提供了更多選擇；⑤口服免疫的最佳選擇，2011年Whitney等[18]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Lm作為HIV口服式疫苗時不會減弱抗HIV-gag的免疫效應(yīng)。另外，目前并未發(fā)現(xiàn)Lm的胞內(nèi)寄生和其致病性的必然關(guān)系，比如目前關(guān)于其致病性報(bào)道最多的是其可隨食品傳染人類并導(dǎo)致嚴(yán)重的致病甚至死亡，但對其原始宿主，如牛、豬、羊等畜類，并未發(fā)現(xiàn)其嚴(yán)重的致病性，這為其作為除人類之外的動物減毒疫苗載體提供了可能性。水產(chǎn)品也是Lm的寄主之一，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Lm幾乎可以寄生全部水產(chǎn)品，但并未有報(bào)道由其引發(fā)的水產(chǎn)品疾病爆發(fā)[19]。2001年Dietrich等[20]發(fā)現(xiàn)用Lm(EGD-e)分別感染鯉魚上皮細(xì)胞、刀劍尾魚胚胎細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞三種細(xì)胞，Lm均可在24 h內(nèi)高效入侵三種細(xì)胞且無差異。因此，早在1996年前后Horne(1997)、Menudier(1996)、Jeyasekaran(1996)等人就提出Lm有望在將來成為漁用疫苗載體[21-23]，但遺憾的是迄今為止并未發(fā)現(xiàn)以其為載體的漁用疫苗上市。

3減毒活載體疫苗載體構(gòu)建及高效抗原遞呈新策略

在活細(xì)菌作為疫苗載體的研究中，抗原基因通常克隆至相應(yīng)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)進(jìn)而整合至細(xì)菌染色體內(nèi)，解決了抗原在遞呈過程中容易降解、免疫原性易丟失等問題[24]。然而在抗原表達(dá)系統(tǒng)中質(zhì)粒需要經(jīng)過抗生素篩選，無法保證其安全性和免疫效果。首先，抗生素殘留進(jìn)入生物環(huán)境中會導(dǎo)致抗生素污染甚至引發(fā)細(xì)菌耐藥性問題[25]；而且，在具有抗性的環(huán)境下抗原表達(dá)量會隨著質(zhì)粒丟失而下降，最終導(dǎo)致免疫效果低下[26]。因此，選擇合適的抗原遞呈方式是提高細(xì)菌載體疫苗免疫效果的有效手段。目前，減毒微生物遞呈疫苗的新策略主要包括平衡致死載體和細(xì)菌表面展示技術(shù)。

3.1平衡致死載體系統(tǒng)(Balanced lethal vector system)該載體系統(tǒng)針對某些關(guān)系細(xì)菌生死的關(guān)鍵基因，采用“質(zhì)粒攜帶，菌株缺失”的原則設(shè)計(jì)，使得菌株的存活依賴于質(zhì)粒所攜帶的關(guān)鍵基因，從而提高質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性并擺脫對抗生素的依賴。在針對Lm的研究中發(fā)現(xiàn)dal和dat基因分別控制D-丙氨酸消旋酶和D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的合成，dal、dat基因雙缺失的Lmdd無法合成細(xì)胞壁[27]?；诖嗽順?gòu)建的突變Lmdd菌株是目前最成功的減毒Lm疫苗載體。該系統(tǒng)構(gòu)建原理是在Lm中敲除dal和dat基因，之后在穿梭載體中表達(dá)dal基因操縱子并篩選穩(wěn)定的突變菌株，基于這種“平衡致死系統(tǒng)”構(gòu)建的突變菌株無需抗生素篩選壓力以確保減毒Lm的存活，有效地解決了最早的減毒活載體疫苗使用中抗生素污染問題，即“綠色減毒疫苗活載體”。 Gaia等[28]在利用減毒Lm作為猴免疾缺陷病毒(Simian immune virus,SIV)疫苗載體的研究中,構(gòu)建Lmdd平衡致死載體并外源表達(dá)SIV-gag(如圖2所示)。結(jié)果在口服接種獼猴后同時產(chǎn)生了針對SIV和Lm的細(xì)胞免疫反應(yīng)。另外，其他平衡致死載體系統(tǒng)，如基于asd等基因缺失的載體系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、愛德華氏菌等細(xì)菌載體疫苗的設(shè)計(jì)中[29-32]。

3.2細(xì)菌表面展示系統(tǒng)(Bacterial surface display system)免疫效果不佳是目前制約細(xì)菌載體疫苗臨床應(yīng)用的最大障礙，其原因在于外源抗原基因在伴隨細(xì)菌進(jìn)入宿主內(nèi)表達(dá)量不足。目前解決此類問題的方法主要集中在如何使抗原基因在進(jìn)入宿主機(jī)體后表達(dá)并分泌至細(xì)菌表面。表面展示技術(shù)使得抗原分泌至細(xì)菌表面，易被免疫系統(tǒng)識別。另外，細(xì)菌的脂多糖、外膜蛋白等能刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異免疫。這種類似免疫佐劑功能的疫苗設(shè)計(jì)理念具有獨(dú)特的優(yōu)勢[33]。目前在疫苗載體研究領(lǐng)域，表面展示技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于沙門氏菌、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌等[34-36]微生物。其基本原理(如圖3所示)是將外源蛋白基因序列與特定的錨定蛋白基因序列融合后導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞，在信號肽的引導(dǎo)下融合蛋白向細(xì)胞外分泌，被展示的外源蛋白可保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性[37]。由于革蘭氏陰性菌遺傳背景比較清楚,更便于控制蛋白的展示,因而研究主要集中在革蘭氏陰性菌。而革蘭氏陽性菌跨外膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚不清楚,目前還未有將表面展示技術(shù)應(yīng)用于Lm的研究報(bào)道。但從應(yīng)用角度來看,革蘭氏陽性菌的某些特性更適合于表面展示:首先,革蘭氏陽性菌的蛋白表面展示系統(tǒng)有著相同或類似的表面錨定機(jī)制,允許多達(dá)幾百個氨基酸的外源蛋白插入。再者,革蘭氏陽性菌所展示的蛋白只需通過單個質(zhì)膜層,而革蘭氏陰性菌的展示蛋白不僅要通過質(zhì)膜層還要在外膜上正確的整合,這對展示蛋白的結(jié)構(gòu)和活性可能產(chǎn)生影響。而且,革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁較厚,因而更堅(jiān)固而易于操作[38]。在不久的將來，隨著革蘭氏陽性菌外膜蛋白自主轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究的不斷深入，將表面展示技術(shù)應(yīng)用于Lm以提高抗原遞呈效率的方式可能成為現(xiàn)實(shí)。

圖2　Lmdd-SIV-gag平衡致死載體系統(tǒng)的構(gòu)建[29]Fig.2　Construction of Lmdd-SIV-gag[29]

4展望

疫苗遞送系統(tǒng)與其產(chǎn)生的免疫效力直接相關(guān)，如何將免疫原高效地送到MHCⅠ和MHCⅡ類分子并提呈至細(xì)胞表面是目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Lm全基因組2001年測序成功至今才15年，其作為疫苗載體的潛力仍未完全開發(fā)。除平衡致死載體和細(xì)菌表面展示技術(shù)外，很多高效遞呈疫苗的新策略還未應(yīng)用于Lm疫苗載體的研究中。如Guan等[40]將二元調(diào)控機(jī)制引入重組大腸桿菌作為疫苗載體的研究中，當(dāng)大腸桿菌攜帶抗原進(jìn)入機(jī)體后，PviuB調(diào)控機(jī)制作用從而誘導(dǎo)抗原基因表達(dá)。此類調(diào)控機(jī)制在高效表達(dá)抗原方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，在Lm作為疫苗載體的研究中值得借鑒。另外，減毒微生物疫苗載體的安全性同樣是細(xì)菌載體疫苗研究過程中不可忽視的因素。因此，對Lm毒力基因進(jìn)行深入探討，尋找最佳的減毒靶標(biāo)基因，提高其使用安全性同樣是未來研究的主攻方向。相信隨著對Lm毒力基因和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制認(rèn)識的深入，不斷會有高效遞呈疫苗的新策略出現(xiàn)并極大促進(jìn)Lm作為疫苗載體研究的發(fā)展。

圖3　細(xì)菌表面展示技術(shù)錨定系統(tǒng)Fig.3　Bacterial surface display system

參考文獻(xiàn)：

[1]Lecuit M,Cossart P.Genetically-modified-animal models for human infections:the Listeria paradigm[J].Trends Mol Med,2002,8:537-542.

[2]Glaser P,Frangeul L,Buchrieser C,etal.Comparative genomics of Listeria species[J].Science,2001,294:849-852.

[3]Vázquez-Boland JA,Kuhn M,Berche P,etal.Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants[J].Clin Microbiol Rev,2001,14:584-640.

[4]Liang ZZ,Sherrid AM,Wallecha A,etal.Listeria monocytogenes:A promising vehicle for neonatal vaccination[J].Hum Vaccin Immunother,2014,10:1036-1046.

[5]Miller EA,Spadaccia MR,Norton T,etal.Attenuated listeria monocytogenes vectors overcome suppressive plasma factors during HIV infection to stimulate myeloid dendritic cells to promote adaptive immunity and reactivation of latent virus[J].AIDS Res Hum Retroviruses,2015,31(1):127-136.

[6]Cory L,Chu C.ADXS-HPV:A therapeutic Listeria vaccination targeting cervical cancers expressing the HPV E7 antigen[J].Hum Vaccin Immunother,2014,10(11):3190-3195.

[7]Quispe-Tintaya W,Chandra D,Jahangir A,etal.Nontoxic radioactive Listeriaat is a highly effective therapy against metastatic pancreatic cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110:8668-8673.

[8]Bertrand Toussaint,Xavier Chauchet,Yan Wang,etal.Live-attenuated bacteria as a cancer vaccine vector[J].Expert Rev Vaccines,2013,12(10):1139-1154.

[9]Bruhn KW,Craft N,Miller JF.Listeria as a vaccine vector[J].Microbes Infect,2007,9(10):1226-1235.

[10]Wolff JA,Malone RW.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo[J].Science,1990,247(4949):1465-1468.

[11]Coley WB.The treatment of malignat tumors by repeated inoculations of erysipelas:with a report of ten original cases[J].Clin Orthop Relat Res,1893,105(5)：487-510.

[12]Cummins J,Tangney M.Bacteria and tumours:causative agents or opportunistic inhabitants?[J].Infect Agent Cancer,2013,8:11.

[13]Toussaint B,Chauchet X,Wang Y,etal.Live-attenuated bacteria as a cancer vaccine vector[J].Expert Rev Vaccines,2013：1139-1154.

[14]VazquezBoland JA,Kuhn M,Berche P,etal.Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants[J].Clin Microbiol Rev,2001,14(3):584-640.

[15]Steffen Jung,Derya Unutmaz,Phillip Wong,etal.In vivo depletion of CD11c+dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens[J].Immunity,2002,17:211-220.

[16]Yin Y,Tian D,Jiao H,etal.Pathogenicity and immunogenicity of a mutant strain of Listeria monocytogenes in the chicken infection model[J].Clin Vaccine Immunol,2011,18(3):500-505.

[17]Loeffler DI,Schoen CU,Goebel W,etal.Comparison of different live vaccine strategies in vivo for delivery of protein antigen or antigen-encoding DNA and mRNA by virulence-attenuated Listeria monocytogenes[J].Infect Immun,2006,74(7):3946-3957.

[18]Whitney JB,Mirshahidi S,Lim SY,etal.Prior exposure to an attenuated Listeria vaccine does not reduce immunogenicity:pre-clinical assessment of the efficacy of a Listeria vaccine in the induction of immune responses against HIV[J].J Immun Based Ther Vaccines,2011,9(1):1-7.

[19]Hassan Momtaz,Shole Yadollahi.Molecular characterization of Listeria monocytogenes isolated from fresh seafood samples in Iran[J].Diagn Pathol,2013,8(1):149.

[20]Dietrich G,Kolb-M?urer A,Spreng S,etal.Gram-positive and Gram-negative bacteria as carrier systems for DNA vaccines[J].Vaccine,2001,19(17-19):2506-2512.

[21]Horne MT.Technical aspects of the administration of vaccines[J].Dev Biol Stand,1997,90:79-89.

[22]Menudier A,Rougier F,Bosgiraud C.Comparative virulence between different strains of Listeria in zebrafish (Brachydanio rerio) and mice[J].Pathol Biol (Paris),1996,44(9):783-789.

[23]Jeyasekaran G,Karunasagar I,Karunasagar I.Incidence of Listeria spp.in tropical fish[J].Int J Food Microbiol,1996,31(1-3):333-340.

[24]Shata MT,Stevceva L,Agwale S,etal.Recent advances with recombinant bacterial vaccine vectors[J].Mol Med Tod,2000(6):66-71.

[25]Frey J.Biological safety concepts of genetically modified live bacterial vaccines[J].Vaccine,2007，25:5598-5605.

[26]Kim K,Jeong JH,Lim D,etal.A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS[J].PloS one,2013,8:e60511.

[27]Thompson RJ,Bouwer HA,Portnoy DA,etal.Pathogenicity and immunogenicity of a listeria monocytogenes strain that requiresd-alanine for growth[J].Infect Immun,1998,66 (8):3552-3561.

[28]Sciaranghella G,Lakhashe S K,Ayash-Rashkovsky M,etal.A live attenuated Listeria monocytogenes vaccine vector expressing SIV Gag is safe and immunogenic in macaques and can be administered repeatedly[J].Vaccine,2011,29 (3):476-486.

[29]Xin W,Wanda SY,Zhang X,etal.The Asd+-DadB+dual-plasmid system offers a novel means to deliver multiple protective antigens by a recombinant attenuated Salmonella vaccine[J].Infect Immun,2012,80 (10):3621-3633.

[30]Borsuk S,Mendum TA,Fagundes MQ,etal.Auxotrophic complementation as a selectable marker for stable expression of foreign antigens in Mycobacterium bovis BCG[J].Tuberculosis (Edinb),2007,87:474-480.

[31]Vidal L,Pinsach J,Striedner G,etal.Development of an antibiotic-free plasmid selection system based on glycine auxotrophy for recombinant protein overproduction in Escherichia coli[J].J Biotechnol,2008,134:127-136.

[32]Yan Y,Mu W,Zhang L,etal.Asd-based balanced-lethal system in attenuated Edwardsiella tarda to express a heterologous antigen for a multivalent bacterial vaccine[J].Fish Shellfish Immunol,2013,34 (5):1188-1194.

[33]uhlén SS.Bacterial surface display:trends and progress[J].Trends Biotechnol,1997,15 (5):185-192.

[34]Zhang J,De Masi L,John B,etal.Improved delivery of the OVA-CD4 peptide to T helper cells by polymeric surface display on Salmonella[J].Microb Cell Fact,2014,13:80.

[35]Sun H,Wang L,Wang T,etal.Display of Eimeria tenella EtMic2 protein on the surface of Saccharomyces cerevisiae as a potential oral vaccine against chicken coccidiosis[J].Vaccine,2014,32 (16):1869-1876.

[36]Wang X,Chen W,Tian Y,etal.Surface display of Clonorchis sinensis enolase on Bacillus subtilis spores potentializes an oral vaccine candidate[J].Vaccine,2014,32 (12):1338-1345.

[37]Lee SY,Choi JH,Xu Z.Microbial cell-surface display[J].Trends in biotechnology,2003,21 (1):45-52.

[38]Schneewind O,Missiakas DM.Protein secretion and surface display in Gram-positive bacteria[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2012,367 (1592):1123-1139.

[39]Guan L,Mu W,Champeimont J,etal.Iron-regulated lysis of recombinant Escherichia coli in host releases protective antigen and confers biological containment[J].Infect Immun,2011,79:2608-2618.

[收稿2015-06-25修回2015-07-13]

(編輯張曉舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.028

作者簡介：丁承超(1992年-)，男，碩士，主要從事病原微生物疫苗研究，E-mail:ding10118026@163.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：劉箐(1970年-)，男，博士，教授，主要從事食源性致病菌致病機(jī)理及控制研究研究，E-mail:liuq@usst.edu.cn。

中圖分類號R392.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0892-04

①本文受國家自然科學(xué)基金(No. 31371776)和上海市科委重點(diǎn)支撐項(xiàng)目(No.13430502400)資助。