艾灸不同溫度熱刺激對小鼠神闕穴局部形態(tài)及肥大細(xì)胞的影響

王應(yīng)越　王耀帥　李　梅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇　南京　210023)

艾灸不同溫度熱刺激對小鼠神闕穴局部形態(tài)及肥大細(xì)胞的影響

王應(yīng)越王耀帥李梅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210023)

〔摘要〕目的探討艾灸不同溫度熱刺激對小鼠神闕穴施灸局部效應(yīng)的影響。方法觀察艾灸不同溫度(38℃、46℃)熱刺激對小鼠神闕穴施灸局部皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變以及肥大細(xì)胞的變化。結(jié)果不同的溫?zé)岽碳た梢圆煌潭鹊赜绊懮耜I穴局部的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞。艾灸的熱刺激對C57BL/6J野生型小鼠與TRPV1-/-小鼠皮膚組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響存在差異。辣椒堿化學(xué)刺激對小鼠皮膚組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響不明顯。不同溫度的艾灸熱刺激對小鼠神闕穴施灸局部肥大細(xì)胞的影響存在差異。46℃的熱刺激能夠明顯的使野生型小鼠局部皮膚肥大細(xì)胞數(shù)目增多，使肥大細(xì)胞脫顆粒。結(jié)論艾灸不同的溫?zé)岽碳た梢圆煌潭鹊赜绊懮耜I穴施灸局部組織的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞，艾灸的熱刺激所致的皮膚神經(jīng)源性炎癥可能與激活TRPV1相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕艾灸；溫?zé)岽碳?；肥大?xì)胞；TRPV1；針灸效應(yīng)

皮膚是艾灸刺激的直接作用部位，局部皮膚適宜溫?zé)岽碳さ倪x擇、刺激的反應(yīng)特征及啟動相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制的過程均以皮膚的生物學(xué)特征為基礎(chǔ)。現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)研究表明〔1〕，軀體及皮膚組織中分布有感受不同溫度范圍的蛋白受體(瞬時感受器電位家族，TRP)，它們有著各自不同的溫度感受閾值，可被不同的溫?zé)岽碳にせ?。艾灸療法引起的局部溫度變化特征，與TRP相關(guān)亞型感受溫度的范疇及分布特點(diǎn)有很大的契合，如TRPV1可被熱刺激(>43℃)激活〔2〕。本文擬探究低于和高于43℃的2種溫度的艾灸熱刺激對施灸局部皮膚產(chǎn)生的效應(yīng)及其是否受到TRPV1激活的影響而存在差異。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物2月齡C57BL/6J野生型小鼠和TRPV1-/-小鼠。C57BL/6J野生型小鼠，體重18～22 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司〔許可證號：SCXK(滬)2007-0005〕，TRPV1-/-小鼠，由南京大學(xué)模式動物研究中心提供，將動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(清潔級)內(nèi)，相同的生存環(huán)境，正常進(jìn)食水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)動物分為正常對照組；TRPV1-/-對照組；艾灸1組；艾灸2組；藥物對照組；TRPV1-/-艾灸對照組。

1.2實(shí)驗(yàn)器材動物用清艾灸條(直徑7 mm，南陽漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司)、辣椒素軟膏(長春普華制藥股份有限公司)、溫度測量儀(HC-04型，杭州洪昌科技有限公司)、0.5%甲苯胺藍(lán)染液(甲苯胺藍(lán)染料0.5 g，用蒸餾水定容至100 ml)、分化液(冰醋酸0.5 ml、蒸餾水99.5 ml混合搖勻)。液狀石蠟、中性樹膠(均為上海標(biāo)本模型廠)、甲醛、二甲苯、無水乙醇(均為南京寧試化學(xué)試劑有限公司)、全自動組織處理儀(TP1020，德國LEICA公司)、石蠟切片機(jī)(RM2145，德國LEICA公司)、光學(xué)顯微鏡(BX60，日本OLYMPUS公司)、攝像儀(DP71圖像獲取系統(tǒng)，日本OLYMPUS公司)、圖像分析儀(CMIAS98A，北京航空航天大學(xué))、圖像分析軟件(南京大學(xué)捷達(dá)公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1艾灸條及藥物干預(yù)方法用手術(shù)剪刀將實(shí)驗(yàn)小鼠神闕穴局部體毛輕輕剪去，以皮膚完全暴露，但不劃傷為度。神闕穴的定位方法采用擬人比照法。待小鼠行為狀態(tài)平穩(wěn)后置于專用固定架上，各組給予相應(yīng)的刺激干預(yù)。正常對照組：不予野生型小鼠艾灸及藥物干預(yù)刺激，平行對照觀察。TRPV1-/-對照組：不予TRPV1-/-小鼠艾灸及藥物干預(yù)刺激，平行對照觀察。艾灸1組：用定制的動物用細(xì)艾條點(diǎn)燃后，正對野生型小鼠神闕穴，進(jìn)行艾灸刺激10 min，將溫度控制儀探頭置于施灸穴位皮膚表面以監(jiān)測實(shí)時溫度，通過調(diào)節(jié)艾條與施灸穴位的距離，將施灸局部皮膚溫度控制在(38℃±1℃)，艾灸2組：干預(yù)方法與艾灸1組相似，在艾條灸熱刺激時，將施灸局部皮膚溫度控制在(46℃±1℃)。藥物對照組：予野生型小鼠神闕穴，涂抹適量辣椒堿軟膏。TRPV1-/-艾灸對照組：予TRPV1-/-小鼠神闕穴，艾條灸熱刺激，干預(yù)方法同艾灸2組。在干預(yù)或平行觀察結(jié)束后30 min內(nèi)，將小鼠拉頸處死，取材。用眼科鑷和手術(shù)剪刀快速取出各組小鼠神闕穴局部皮膚組織，放于10%甲醛溶液保存固定1 w。

1.3.2染色前處理(1)修塊：將剪取下放置在10%的甲醛溶液中固定1 w的小鼠神闕穴局部的皮膚組織取出，用手術(shù)刀片對組織進(jìn)行修塊，約0.7 cm×0.7 cm×0.3 cm大小，再放入70%的乙醇中將組織上殘留的甲醛溶液洗去。(2)脫水：將完成修塊的組織放入全自動組織處理儀進(jìn)行脫水處理。(3)包埋：對經(jīng)處理后的組織進(jìn)行石蠟包埋。(4)切片：用切片機(jī)進(jìn)行常規(guī)切片，片厚5～6 μm，放入熱水中攤平；再用標(biāo)記好的載玻片撈片，撈片時速度要慢，起水后迅速甩去水，防止組織和玻片間形成氣泡，若有氣泡要仔細(xì)用針灸針戳破；在烤片板上烤至石蠟透明，放入烤片箱中，60℃～64℃烘烤過夜，晾涼后備用。

1.3.3蘇木素-伊紅(HE)染色(1)石蠟切片脫蠟至水；(2)蘇木素染液染色5 min；(3)快速放入1%鹽酸乙醇中進(jìn)行分化；(4)用清水洗滌后，放入促返藍(lán)液中10 min；(5)返藍(lán)結(jié)束后，梯度酒精上行脫水；(6)二甲苯透明；(7)樹膠封片。

1.3.4甲苯胺藍(lán)染色(1)切片常規(guī)脫蠟至水；(2)0.5%甲苯胺藍(lán)液浸染；(3)水洗，洗去多余染液；(4)分化液分化；(5)水洗、風(fēng)干；(6)各級酒精脫水；(7)二甲苯透明；(8)中性樹膠封片。

1.3.5圖像采集用光學(xué)顯微鏡觀察玻片上組織的形態(tài)，找到有效信息，用攝像儀進(jìn)行圖像的拍攝，拍攝倍數(shù)為10×10，再用圖像分析儀及形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)將獲取的圖像信息進(jìn)行處理分析。

2結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果圖1可見，(1)正常對照組：穴位局部表皮完整，角化層薄，表皮厚度約有3～5層細(xì)胞；表皮結(jié)構(gòu)正常，基底層、棘層以及顆粒細(xì)胞層的構(gòu)成和排列都未見異常改變，真皮層結(jié)構(gòu)正常，膠原纖維束排列致密，染色呈鮮明紅色，其間可見毛囊、皮脂腺散在分布，皮下組織結(jié)構(gòu)正常。(2)TRPV1-/-對照組：穴位局部表皮完整，角化層薄，表皮厚度約有3～5層細(xì)胞；結(jié)構(gòu)正常，基底層、棘層以及顆粒細(xì)胞層都未見異常改變，真皮層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，膠原纖維束排列疏松，其間毛囊顯著大量增生，可見皮脂腺分布，皮下組織結(jié)構(gòu)正常。(3)艾灸1組：施灸局部皮膚角化層極薄且剝離，但表皮完整，只有2～3層細(xì)胞；基底層、棘層以及顆粒細(xì)胞層分層不明顯；真皮層膠原纖維束排列疏松，有的地方膠原纖維束缺如；膠原纖維束染色呈淡染著色狀，毛囊和皮脂腺部分缺失；皮下組織結(jié)構(gòu)未見明顯改變，未見炎性細(xì)胞浸潤。(4)艾灸2組：施灸局部組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，局部皮膚角化層剝離缺如、表皮細(xì)胞1～2層，真皮改變較大，厚度較正常真皮厚，膠原纖維束發(fā)生變性，表現(xiàn)為纖維束不成束狀分布，而呈均質(zhì)玻璃樣結(jié)構(gòu)改變，局部染色呈紅染著色狀，及其中的毛囊、皮脂腺破壞丟失較多，皮下組織結(jié)構(gòu)不完整，膠原纖維排列疏松，局部出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤。(5)藥物對照組：穴位局部表皮完整，角化層薄，表皮厚度約有3～5層細(xì)胞；表皮結(jié)構(gòu)正常，基底層、棘層以及顆粒細(xì)胞層都未見異常改變，連續(xù)真皮層結(jié)構(gòu)正常，膠原纖維束排列致密，染色呈鮮明紅色，其間可見毛囊、皮脂腺增多，皮下組織結(jié)構(gòu)正常。(6)TRPV1-/-艾灸組：施灸局部組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，局部皮膚角化層剝離缺如、表皮細(xì)胞1～2層，真皮層結(jié)構(gòu)異常，膠原纖維束發(fā)生變性，不成束狀分布，亦呈均值玻璃樣結(jié)構(gòu)改變，其間毛囊顯著大量增生，但破壞丟失較多，皮下組織結(jié)構(gòu)不完整。

2.2甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果圖2可見，通過甲苯胺藍(lán)染色顯示組織中肥大細(xì)胞。肥大細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有肝素和組織胺等異色性物質(zhì)遇到甲苯胺藍(lán)可呈異染性紫紅色，組織底色為淡藍(lán)色。(1)正常對照組：每個鏡下視野內(nèi)可見2～3個肥大細(xì)胞，呈橢圓形，分布較為分散，胞體較小。(2)TRPV1-/-對照組：每個鏡下視野內(nèi)可見4～5個肥大細(xì)胞，呈橢圓形，分布較為分散，胞體較小。(3)艾灸1組：每個鏡下視野內(nèi)可見7～8個肥大細(xì)胞，呈橢圓形，分布適中，胞體稍肥大，有個別出現(xiàn)脫顆粒的結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞周圍可見溢出的顆粒存在，以及胞體不再是橢圓形的各種形態(tài)改變。(4)艾灸2組：每個鏡下視野內(nèi)可見15～20個肥大細(xì)胞，呈圓形或橢圓形，分布集中，胞體肥大，大多數(shù)肥大細(xì)胞發(fā)生脫顆粒的上述形態(tài)學(xué)改變。(5)藥物對照組：每個鏡下視野內(nèi)可見5～6個肥大細(xì)胞，呈圓形或橢圓形，分布適中，胞體稍肥大，有部分發(fā)生脫顆粒形態(tài)改變。(6)TRPV1-/-艾灸組：每個鏡下視野內(nèi)可見5-6個肥大細(xì)胞，呈橢圓形，分布適中，胞體稍肥大，有個別出現(xiàn)脫顆粒形態(tài)改變。

圖1　小鼠神闕穴局部皮膚組織HE染色圖片

圖2　小鼠神闕穴局部皮膚組織甲苯胺藍(lán)染色圖片

3討論

體表施灸局部是艾灸作用的直接對象，是艾灸溫通效應(yīng)啟動機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在以往的針灸作用機(jī)制研究過程中，我們更重視針灸治療對疾病靶器官的效應(yīng)，而忽略了針灸啟動靶器官效應(yīng)的獨(dú)特途徑和機(jī)制。任何有效的治療措施均可對靶器官產(chǎn)生影響，而其作用途徑的特異性則是該方法存在的重要基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)關(guān)注艾灸施灸局部的效應(yīng)特點(diǎn)，不僅有助于進(jìn)一步研究艾灸神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò)相互作用的途徑，也為闡明艾灸溫通效應(yīng)的作用機(jī)制提供了新的途徑。

本研究表明，艾灸不同的溫?zé)岽碳た梢圆煌潭鹊赜绊懫つw組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞，局部的這種效應(yīng)可能與艾灸以溫促通的整體效應(yīng)相關(guān)聯(lián)。而TRPV1-/-小鼠與C57BL/6J野生型小鼠在皮膚生理結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)了差異，這種差異可能導(dǎo)致了兩者對于46℃熱刺激存在的功能上的差異，提示并不是外界的刺激就一定能對肥大細(xì)胞產(chǎn)生影響，而是機(jī)體的某種生物學(xué)物質(zhì)也參與到其中?；谝酝难芯俊?,4〕，提示皮膚可能是艾灸發(fā)揮溫通作用的主要效應(yīng)區(qū)。新近的研究認(rèn)為皮膚是重要的神經(jīng)內(nèi)分泌器官，能夠合成及分泌多種神經(jīng)遞質(zhì)及肽類物質(zhì)〔5〕，而TRP通道很可能是艾灸溫?zé)嵝?yīng)的重要潛在分子靶點(diǎn)。TRP通道廣泛分布在機(jī)體的肥大細(xì)胞上〔6〕，主要包括TRPV1和TRPV2，其開放效應(yīng)直接影響肥大細(xì)胞的功能和效用〔5〕。因此，不同的艾灸方法，產(chǎn)生不同的溫度變化特征，激活不同的TRP亞型，誘導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)不同的治療效應(yīng)。而46℃的熱刺激對野生型小鼠與TRPV1-/-小鼠局部皮膚肥大細(xì)胞的不同影響提示，TRPV1可能是與局部皮膚神經(jīng)源性炎癥相關(guān)聯(lián)的物質(zhì)。其他研究者皮膚免疫組織化學(xué)分析也表明，TRPV1是在大鼠和人皮膚神經(jīng)纖維中具有特定的神經(jīng)化學(xué)性的一個小直徑初級傳入纖維，數(shù)據(jù)顯示，TRPV1顯然是與皮膚神經(jīng)源性炎癥有關(guān)〔7，8〕。另外，有研究表明〔9〕，TRPV1可以與C纖維和Aδ纖維的標(biāo)志物peripherine共表達(dá)，提示TRPV1激活后，可以通過該兩種神經(jīng)纖維通路進(jìn)行生物效應(yīng)的級聯(lián)反應(yīng)。綜上所述，艾灸溫通效應(yīng)的啟動機(jī)制與TRPV1相關(guān)。TRPV1與艾灸的熱刺激密切相關(guān)，參與了艾灸熱刺激引發(fā)的皮膚神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，TRPV1在局部被艾灸激活之后，通過穴位局部皮膚、肌肉中的血管、神經(jīng)、體液等，將溫?zé)岬拇碳ば畔⑥D(zhuǎn)化為機(jī)體能識別的生理的功能信息，產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)溫通效應(yīng)。

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〔2015-10-15修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

基金項(xiàng)目：南京中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)基金預(yù)研項(xiàng)目(No.13XYYZ6)

通訊作者：王耀帥(1983-)，男，講師，博士，主要從事針?biāo)幗Y(jié)合與針灸效應(yīng)研究。

〔中圖分類號〕R245.81

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2345-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.014

第一作者：王應(yīng)越(1991-)，男，碩士，主要從事針灸治療神經(jīng)內(nèi)分泌疾病效應(yīng)研究。