幾種微藻餌料對縊蟶稚貝脂質(zhì)營養(yǎng)組成的影響

周 率， 冉照收， 于珊珊， 周海波， 徐繼林， 嚴(yán)小軍

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室， 寧波 315211；2. 福建省寶智水產(chǎn)科技有限公司， 漳州 363503)

幾種微藻餌料對縊蟶稚貝脂質(zhì)營養(yǎng)組成的影響

周 率1， 冉照收1， 于珊珊1， 周海波2， 徐繼林1， 嚴(yán)小軍1

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室， 寧波 315211；2. 福建省寶智水產(chǎn)科技有限公司， 漳州 363503)

摘 要通過用4種縊蟶人工養(yǎng)殖中常用的餌料微藻(角毛藻、球等鞭金藻、威氏海鏈藻、假微型海鏈藻)，以單種餌料和混合餌料的形式對縊蟶稚貝進(jìn)行投喂實驗，研究不同的微藻餌料對縊蟶稚貝的脂肪酸和甾醇組成的影響。對喂食餌料后的縊蟶稚貝進(jìn)行脂肪酸甾醇的GC-MS分析，共檢測到16種脂肪酸和7種甾醇，不同的單種餌料及混合餌料的縊蟶投喂組的脂肪酸、甾醇差異很大。C16:2在含有威氏海鏈藻的單種餌料和混合餌料的投喂組被檢測到；金藻混合藻餌料的縊蟶投喂組脂肪酸種類最豐富(13～15種)，PUFA百分含量最高，膽甾醇含量不高但富含菜子甾醇。因此，從微藻餌料對縊蟶稚貝的脂質(zhì)營養(yǎng)化影響上來說，金藻的混合餌料是最佳餌料。

關(guān)鍵詞微藻；縊蟶；脂肪酸；甾醇；氣象色譜-質(zhì)譜連用分析

脂肪酸與甾醇都是人類重要的脂質(zhì)營養(yǎng)來源，同時也是人體脂肪的重要組成部分。不飽和脂肪酸中的ω-3與ω-6系多不飽和脂肪酸尤為重要，它們對嬰幼兒的大腦發(fā)育有重要的作用[1， 2]。甾醇是人類重要的脂類營養(yǎng)物質(zhì)，也是真核生物膜的重要組成部分。研究表示，植物甾醇具有降血脂、抑制身體對膽固醇的吸收作用[3， 4]。

縊蟶(Sinonovaculaconstricta, Lamarck)，屬軟體動物門竹蟶科縊蟶屬，是中國常見的貝類海產(chǎn)品。貝類富含對人體有重要作用的脂肪酸和甾醇，尤以多不飽和脂肪酸和植物甾醇[5, 6]極為豐富，縊蟶還富含人體生命活動所需的各種必需氨基酸、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)[7]。國內(nèi)對縊蟶生物大分子物質(zhì)的研究也很多，趙艷景等從縊蟶體內(nèi)分離提純出抗氧化活性很強(qiáng)的縊蟶多糖[8]，林文東等發(fā)現(xiàn)縊蟶水提物具有體外抗氧化活性[9]，抗氧化作用是抗疲勞作用的基礎(chǔ)，能加速疲勞修復(fù)[10]。本研究主要研究縊蟶的脂肪酸、甾醇受微藻餌料的影響。

研究顯示，貝類幾乎不具備自身合成和轉(zhuǎn)化甾醇的能力，所以餌料微藻不僅影響人工養(yǎng)殖貝類的生長情況，而且在很大程度上，其體甾醇來源也受微藻餌料脂質(zhì)組成的影響[11，12]。不同貝類，養(yǎng)殖所用的適宜微藻不同。馬斌[13]等通過研究8種常見餌料微藻對縊蟶稚貝存活率和成長速度的影響，認(rèn)為角毛藻(Chaetoceroscalcitrans)和球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)的單藻餌料效果最好，其優(yōu)于綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)、青島大扁藻(Platymonashelgolandica)等。因此，在周海波的實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，本研究選擇了餌料效果最佳的角毛藻和金藻，并增加了近期在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用較好，較為感興趣的假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)和威氏海鏈藻(Thalassiosiraweissflogii)2種餌料微藻，希望通過研究這4種在貝類養(yǎng)殖上餌料效果良好的微藻及其混合藻對縊蟶稚貝脂質(zhì)組成的影響，進(jìn)而從縊蟶的肉質(zhì)脂質(zhì)營養(yǎng)優(yōu)化角度，為縊蟶稚貝的養(yǎng)殖餌料篩選提供更有價值的數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1微藻餌料的培養(yǎng)

本研究的餌料微藻(角毛藻、球等鞭金藻、假微型海鏈藻和威氏海鏈藻)藻種均由寧波大學(xué)海洋生物實驗室藻種實驗室提供，采用“NML3號”培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。藻種于2.5 L錐形瓶中培養(yǎng)1周(20℃±2℃)后轉(zhuǎn)入50 L白色塑料桶中，擴(kuò)大培養(yǎng)約1周，培養(yǎng)溫度23℃～27℃，均在自然光下進(jìn)行培養(yǎng)。每天用CASY-TT顆粒粒度計數(shù)分析儀(德國CASY公司)記錄藻類密度，在生長指數(shù)后期進(jìn)行縊蟶投喂。

1.2縊蟶稚貝的培養(yǎng)

縊蟶苗由福建省紫泥甘文育苗場提供?？O蟶浮游幼蟲附著后在連續(xù)充空氣的水泥池中進(jìn)行培養(yǎng)。每天投喂足量的初始混合藻餌料(角毛藻、球等鞭金藻、青島大扁藻、云微藻、假微型海鏈藻、威氏海鏈藻等多種藻等比例混合)，藻類細(xì)胞密度保持為80～100 cell/μL。水泥池底鋪高溫滅菌、經(jīng)200目(直徑75 μm)尼龍篩絹過濾的干凈海泥(厚度大于1 mm)，自然海水(鹽度10)經(jīng)沙濾后引入水泥池。稚貝在18℃～26℃下培養(yǎng)12 d后，取出少量于干凈海水中饑餓處理24 h后用蒸餾水洗凈，冷藏為空胃對照組(即實驗前樣品)；剩余縊蟶饑餓處理12 h(排空胃中食物)，進(jìn)行餌料投喂實驗[13, 20]。

1.3縊蟶稚貝餌料投喂實驗

將饑餓處理12 h的縊蟶分為10組，每組3平行。每平行稱取濕重1 g的縊蟶稚貝均勻撒入28 cm×15 cm×10 cm (長×寬×高)的白色塑料盆中，盆中海泥和海水條件與上述水泥池相同。每實驗盆按實驗要求投入足量單一微藻餌料或兩兩等比例混合后的混合微藻餌料。實驗盆微藻細(xì)胞密度均為100～120 cell/μL，每4～5 d更新海水和海泥，在自然溫度(18℃～26℃)下培養(yǎng)12 d后于干凈海水中饑餓處理24 h，蒸餾水洗凈縊蟶稚貝后收集冷藏樣品。

1.4縊蟶脂質(zhì)的提取和GC-MS檢測

1.4.1脂肪酸和甾醇的提取

用冷凍干燥機(jī)(美國LABCONCO公司)干燥縊蟶樣品去除水分，稱取約30 mg干樣研磨成粉末，參考改進(jìn)的Bligh-Dyer法提取總脂[14，15]。提取總脂后加入2 mL 5%～6%氫氧化鉀甲醇水(體積比為4∶1)，充氮氣1 min，密封后60 ℃水浴皂化2 h，冷卻后用氯仿和正己烷(體積比為1∶4)6 mL分3次進(jìn)行提取，往提取液中加入3 g無水硫酸鈉，靜置吸水12 h，將液體用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空干燥，加入100 μL過量BSTFA，密封后60℃水浴1 h。氮氣吹干后用色譜純正己烷(美國TEDIA公司)復(fù)溶解樣品，進(jìn)樣進(jìn)行GC-MS分析。實驗中其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.4.2GC-MS檢測條件

采用QP2010氣相色譜-質(zhì)譜分析儀，帶AOC-20自動進(jìn)樣器(日本SHIMADZU公司)，30 m×0.25 mm×0.25 btm SPB-50色譜柱(美國SUPELCO公司)；標(biāo)準(zhǔn)品購自美國SIGMA-ALDRICH公司。GC采用分流進(jìn)樣模式，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為高純氦，柱流速0.81 mL/min，柱前壓73.0 kPa，柱起始溫度150 ℃，保持3.5 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至280 ℃后，保持30 min。MS用電子轟擊源(electron impact, EI)分析，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，選擇全程離子碎片掃描(SCAN)模式，質(zhì)量掃描范圍為50～600 m/z。

1.5數(shù)據(jù)的處理與分析

根據(jù)GC-EIMS-TIC中各組分的離子碎片質(zhì)量圖譜，通過對NIST庫和WILEY庫檢索并參考脂肪酸和甾醇標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行鑒定[16]。用面積歸一法計算脂肪酸和甾醇組分的百分含量。不同餌料微藻投喂下脂肪酸和甾醇組成的數(shù)據(jù)用SPSS 12.0進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性水平P<0.05。

2結(jié)果與分析

2.1不同餌料對縊蟶脂肪酸的影響

實驗共檢測到16種脂肪酸，結(jié)果見表1。可以看出，不同微藻的單種餌料和混合餌料所投喂的縊蟶稚貝在脂肪酸種類數(shù)量上存在差異；作為脂肪酸組分的單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)、飽和脂肪酸在含量上也存在明顯差異。實驗組的不飽和脂肪酸(UFA)百分含量均明顯高于飽和脂肪酸(SFA)，空胃對照組的UFA百分含量略低于SFA。脂肪含量最豐富的應(yīng)屬畜肉類，但畜肉脂肪多為SFA，而SFA含量過高則會導(dǎo)致動脈粥樣硬化[17]，貝類食品的脂質(zhì)與陸生動植物的脂質(zhì)相比，具有組成復(fù)雜、PUFA含量較高的優(yōu)勢[18，19]。

通過徐繼林[20]、楊帆[21]等人的研究，引用其對微藻脂肪酸的研究結(jié)果(如表3)，本實驗所用4種微藻餌料在脂肪酸種類和含量上均有差異，其中以金藻所含UFA含量最高(75.8%)，角毛藻次之(75.2%)。此外，投喂不同餌料12 d后，發(fā)現(xiàn)縊蟶稚貝的存活率存在差異，角毛藻和金藻投喂組的空殼較少。對縊蟶稚貝進(jìn)行脂質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)針對脂肪酸種類豐富度，空胃組檢測出10種脂肪酸；餌料投喂的實驗組脂肪酸種類均多于空胃組，按表1順序檢測到的種類分別是12種、13種、10種、11種及15種、10種、11種、13種、14種、11種，其中，縊蟶脂肪酸種類豐富度最高的餌料分別是：角毛藻+金藻(15種)、金藻+威氏海鏈藻(14種)、金藻+假微型海鏈藻(13種)、金藻(13種)等。其次，針對UFA和SFA百分含量高低，空胃組與實驗組呈現(xiàn)了明顯差異，僅空胃組SFA(51.40%)含量高于UFA(48.60%)，其余微藻餌料投喂組則是UFA含量均高于SFA。其中，將表1所有微藻餌料投喂組的UFA含量從高到低排列：角毛藻+金藻(70.49%)、金藻+假微型海鏈藻(69.75%)、角毛藻+威氏海鏈藻(66.85%)、金藻+威氏海鏈藻(65.31%)等。UFA分為MUFA和PUFA?？瘴附MMUFA百分含量為19.39%，角毛藻+威氏海鏈藻混合餌料的縊蟶投喂組MUFA百分含量最高且高達(dá)42.32%，明顯高于其它微藻餌料投喂組(19.39%～36.59%)。角毛藻+威氏海鏈藻混合餌料投喂組的MUFA中，油酸(C18:1)的含量明顯高于其它實驗組微藻餌料(20.64%)。PUFA根據(jù)雙鍵的位置和功能分為ω-3與ω-6系列。ω-3系列中最常見的是廿碳五烯酸(EPA)和廿二碳六烯酸(DHA)，ω-3系列的PUFAs具有一定抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的功能[22， 23]；ω-6系列以花生四烯酸(AA)最常見，也有研究發(fā)現(xiàn)，AA產(chǎn)生的自由基最多，相比于EPA和DHA，AA具有更高的抗腫瘤活性[24]。本實驗結(jié)果顯示，AA的含量以角毛藻的單種餌料和含角毛藻的混合餌料投喂組最高(4.60%～6.69%)?？瘴附M只檢測到EPA(16.18%)的存在，將餌料投喂組按EPA+DHA的含量從高到低順序排列，分別是：假微型海鏈藻(28.9%)、假微型海鏈藻+威氏海鏈藻(26.9%)、威氏海鏈藻(26.67%)、金藻+假微型海鏈藻(24.85%)等。假微型海鏈藻與威氏海鏈藻的縊蟶投喂組EPA+DHA百分含量較高，這很可能與這兩種海鏈藻自身EPA和DHA含量均高于角毛藻和金藻有關(guān)[21]?？偠灾?，將所有餌料投喂組的PUFA百分含量從高到低排序，分別是：金藻+假微型海鏈藻(42.64%)、角毛藻+金藻(39.84%)、金藻+威氏海鏈藻(33.81%)及假微型海鏈藻(32.45%)等。

根據(jù)實驗結(jié)果，我們認(rèn)為：金藻的單種餌料和含金藻的混合餌料，在提高養(yǎng)殖縊蟶脂肪酸種類豐富度和縊蟶UFA含量上，效果優(yōu)于其它微藻餌料實驗組，其次為角毛藻和含角毛藻的混合餌料。這可能與金藻、角毛藻本身的脂肪酸組成和縊蟶稚貝對外源脂肪酸的攝入與轉(zhuǎn)化機(jī)制相關(guān)；此外，我們還認(rèn)為金藻的混合餌料在提高縊蟶稚貝PUFA含量上，效果優(yōu)于其它微藻餌料實驗組。金藻在提高縊蟶稚貝脂肪酸營養(yǎng)組成上餌料效果更優(yōu)，這與馬斌[13]、楊帆[21]等人對影響縊蟶生長速度及存活率的餌料微藻的研究結(jié)果是具有相似性的。

本研究還發(fā)現(xiàn)C20:2和C20:3僅在金藻的單種餌料和混合餌料的投喂組被檢測到；C21:0僅在金藻的單種餌料和混合餌料的投喂組被檢測到(角毛藻和金藻除外)。除了角毛藻單種餌料與角+金混合餌料的投喂組以外，C16:2僅在威氏海鏈藻的單種餌料和混合餌料的縊蟶投喂組被檢測到。這現(xiàn)象在一定程度上與餌料微藻的脂質(zhì)組成相關(guān)[20，21]。關(guān)于C16:2、C20:2、C20:3和C21:0的作用與意義，我們不在此討論。

2.2不同餌料對縊蟶甾醇的影響

甾醇為真核生物細(xì)胞膜基本組成成分，控制生物膜的流動性和滲透性，在某些植物中，甾醇還具有細(xì)胞信號傳遞、細(xì)胞酶活性調(diào)節(jié)等功能[25]。本研究共檢測出了7種甾醇(表2)，分別為膽甾-5-烯-3β-醇(膽甾醇)C27:1(Δ5)、24-甲基-膽甾-5, 22-二烯醇(菜子甾醇)C28:2(Δ5,22/24Me)、24-甲基-膽甾-5-烯醇(菜油甾醇)C28:1(Δ5/24Me)、4, 4-二甲基-膽甾-7, 24-二烯醇C29:2(Δ7, 24/4, 4diMe)、24-乙基-膽甾-5, 22-二烯醇(豆甾醇)C29:2(Δ5, 22/24Ethy)、24-乙基-膽甾醇(谷甾醇)C29:1(Δ5/24Ethyl)和24-乙基-膽甾-5, 24(28)E-二烯醇(巖藻甾醇)C29:2(Δ5, 24(28)E/24Ethy)。

表2顯示，空胃組、角毛藻的單種餌料和含角毛藻的混合餌料投喂組、假微型海鏈藻的單種餌料和含假微型海鏈藻的混合餌料投喂組、威氏海鏈藻的單種餌料和含威氏海鏈藻的混合餌料投喂組中，均以C27:1(Δ5)百分含量最高(42.20%～91.35%)。金藻的單種餌料和含金藻的混合餌料投喂組(角毛藻和金藻混合餌料除外)未呈現(xiàn)此現(xiàn)象，且均以C28:2(Δ5,22/24Me)為含量最高的甾醇(52.93%～79.64%)，此現(xiàn)象可能與金藻中甾醇含量的特殊性相關(guān)[16]。研究表明，菜子甾醇可以在膽甾醇缺乏時為雙殼類生物提供良好的甾醇類營養(yǎng)物質(zhì)[26]。金藻的單種餌料和含金藻的混合餌料投喂的縊蟶稚貝膽甾醇含量不高且富含菜子甾醇，從縊蟶甾醇的營養(yǎng)價值考慮，我們認(rèn)為金藻的單種餌料和混合餌料(角毛藻和金藻混合餌料除外)的餌料效果最佳。

3結(jié)論

就脂肪酸而言，金藻的混合藻餌料的縊蟶投喂組脂肪酸種類最豐富(13～15種)；金藻的混合藻餌料投喂組比其它微藻餌料投喂組富含對人體有益的UFA，尤其是PUFA含量最高。就甾醇而言，金藻的單種餌料及其混合餌料投喂組的縊蟶，膽甾醇含量不高且富含菜子甾醇，在甾醇整體營養(yǎng)價值更優(yōu)。綜上，本研究認(rèn)為金藻的單種餌料及其混合餌料在對縊蟶稚貝的脂質(zhì)影響上更具有營養(yǎng)價值，在改善縊蟶稚貝脂質(zhì)組成的養(yǎng)殖上更有利用價值。

表1 4種單藻餌料及其混合餌料投喂的縊蟶稚貝脂肪酸組成

表中數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；“-”表示該物質(zhì)未檢測到；同一行數(shù)據(jù)共有相同的字母上標(biāo)，表示差異性不顯著(P>0.05)。SFA：飽和脂肪酸；MUFA：單不飽和脂肪酸；PUFA：多不飽和脂肪酸

表2 4種單藻餌料及其混合餌料投喂的縊蟶稚貝甾醇組成

表中數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；“-”表示該物質(zhì)未檢測到；同一行數(shù)據(jù)共有相同的字母上標(biāo)，表示差異性不顯著(P>0.05)

表3 4種微藻餌料的脂肪酸組成[20, 21]

SFA：飽和脂肪酸；MUFA：單不飽和脂肪酸；PUFA：多不飽和脂肪酸

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Effect of several diets on the composition of fatty acids and sterols in juvenile Sinonovacula constricta

ZHOU Lv1, RAN Zhao-shou1, YU Shan-shan1, ZHOU Hai-bo2, XU Ji-lin1, YAN Xiao-jun1

(1. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211;2. Zhibao Fishery Science Co., Ltd. in Fujian Province, Zhangzhou 363503, China)

AbstractIt is investigated that effects of the four microalgae (Chaetoceros calcitrans, Isochrysis galbana, Thalassiosira pseudonana and Thalassiosira weissflogii) and their mixture, which commonly used as S. constricta rearing diets, on the composition of fatty acids and sterols in juvenile S. constricta. The fatty acid and sterol composition of juveniles were analyzed by GC-MS. The results showed that different diets have effect on fatty acid and sterol compositions in juveniles, and 16 fatty acids and 7 sterols have been detected. C16:2 detected in T. weissflogii and its mix. Juveniles fed with I. galbana mix was abundant in the species of fatty acids(13-15) and C28:1(Δ5/24Me) (Brassicasterol). Besides, the PUFA percentage content of Juveniles fed with I. galbana mix was higher than that of others. Above all, we choose I. galbana mix as optimal diet because they made lipids of S. constricta juveniles more nitrification.

Key wordsmicroalgae; S. constricta; fatty acid; sterol; GC-MS

收稿日期：2015-12-10；修回日期：2016-01-04

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31172448);教育部博士點基金優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域項目(20133305130001)；浙江省公益性項目(2014C32081)；浙江自然科學(xué)基金項目(LY15C190004)；寧波市科技攻關(guān)項目(2013C10014，2014C10005)

作者簡介：周 率，碩士研究生，從事海洋生物化學(xué)研究，E-mail: zhoulv9597@126.com； 通信作者：徐繼林，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向為海洋生物的環(huán)境生態(tài)和養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)研究，E-mail: xujilin@nbu.edu.cn。

中圖分類號Q959.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號2095-1736(2016)03-0052-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.052