劉俊秀劉軼君毛蘭群李學(xué)佩馬芙蓉北京大學(xué)第三醫(yī)院耳鼻咽喉科（北京009）中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所（北京0090）華信醫(yī)院急診科（北京0006）

?

水楊酸鈉對(duì)大鼠下丘多巴胺水平影響的研究

劉俊秀1劉軼君3毛蘭群2李學(xué)佩1馬芙蓉1
1北京大學(xué)第三醫(yī)院耳鼻咽喉科（北京100191）
2中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所（北京100190）
3華信醫(yī)院急診科（北京100016）

【摘要】目的探討聽覺中樞核團(tuán)下丘內(nèi)多巴胺水平的變化在耳鳴發(fā)病機(jī)制中的作用。方法在水楊酸鈉誘導(dǎo)建立的耳鳴動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，利用微透析技術(shù)結(jié)合高效液相電化學(xué)檢測(cè)方法，活體、動(dòng)態(tài)研究水楊酸鈉作用后大鼠下丘內(nèi)多巴胺水平的變化。結(jié)果水楊酸鈉引起大鼠下丘多巴胺水平顯著性地降低。大約3小時(shí)后下丘內(nèi)多巴胺水平降至最低，達(dá)到基礎(chǔ)值的49±9％，然后緩慢的升高，大約5小時(shí)后恢復(fù)到基線水平。生理鹽水對(duì)照組未引起任何明顯的變化。結(jié)論大鼠下丘內(nèi)多巴胺水平的顯著性降低可能與水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳鳴產(chǎn)生有關(guān)，這些活體數(shù)據(jù)為多巴胺這一調(diào)節(jié)人們精神活動(dòng)的重要遞質(zhì)參與耳鳴的發(fā)生提供直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

【關(guān)鍵詞】水楊酸鈉；耳鳴；下丘；多巴胺；微透析；高效液相色譜

This research is financially supported by the NSF of China（30500556，21372020）and NSF of Beijing（7082100，7112144）.

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

面對(duì)臨床上日益增多的耳鳴患者，學(xué)者越來(lái)越關(guān)注耳鳴患者所常常伴有的煩躁、易怒、焦慮及抑郁等精神癥狀，這些精神癥狀與耳鳴形成惡性循環(huán)，給患者帶來(lái)極大的痛苦。有研究表明抑郁癥和精神分裂等精神疾病在發(fā)病機(jī)制中與耳鳴有很多相似之處，甚至有學(xué)者研究認(rèn)為一部分精神分裂癥患者所謂的幻聽實(shí)際上就是一種耳鳴［1-2］。

多巴胺（DA）是當(dāng)前研究得最有成效的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)之一。是調(diào)節(jié)人們精神活動(dòng)和精神依賴的重要遞質(zhì)。中腦-邊緣葉DA系統(tǒng)主要調(diào)控情緒，中腦-大腦皮層DA系統(tǒng)主要參與認(rèn)知功能，對(duì)事物的識(shí)別能力。DA在抑郁癥、精神分裂癥中，都起到重要的作用。在眾多的生物精神病學(xué)研究中，有的學(xué)者認(rèn)為DA功能亢進(jìn)是解釋精神分裂癥發(fā)病機(jī)制的主要生化假說(shuō)［3］。研究者設(shè)想DA神經(jīng)元系統(tǒng)失平衡可能是耳鳴的發(fā)病機(jī)制之一。聽覺中樞單胺類神經(jīng)介質(zhì)與耳鳴的關(guān)系問題一直是近些年的研究熱點(diǎn)。

因此本研究擬在經(jīng)典的水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳鳴動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，利用先進(jìn)的微透析技術(shù)結(jié)合高效液相電化學(xué)檢測(cè)方法在動(dòng)物活體清醒狀態(tài)下動(dòng)態(tài)研究下丘這一重要的聽覺中樞核團(tuán)內(nèi)多巴胺水平的變化，為多巴胺參與耳鳴的發(fā)生發(fā)展提供直接有意義的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物分組

本研究選用16只Wistar大鼠，體重為300～350 g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成腹腔注射水楊酸鈉（350 mg/Kg）耳鳴組（n = 8）和腹腔注射生理鹽水對(duì)照組（n = 8）。將Wistar大鼠置于能夠自由飲水和取食的清醒裝置轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)（BAS，美國(guó)）的動(dòng)物盤中飼養(yǎng)一周，待其適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行微透析探針植入手術(shù)，恢復(fù)24小時(shí)，利用微透析技術(shù)結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)方法實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)下丘神經(jīng)核團(tuán)內(nèi)多巴胺水平的變化。本研究的試驗(yàn)過程符合中科院制定的動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.2藥品與試劑

抗壞血酸鈉鹽、DA，DOPAC，HVA，5-HIAA，5-HT標(biāo)樣及內(nèi)標(biāo)3，4-DHBA（3，4-dihydroxybenzylamine）購(gòu)自Sigma或Aldrich公司。用0.1M的高氯酸配成約1.0×10-3M的儲(chǔ)備液，臨用前混合并用Ringer氏溶液稀釋至所需濃度。Ringer氏液的組成為（mM）：NaCl 149；KCl 3；CaCl2 1.2；MgCl20.8，PH= 6.7。離子對(duì)試劑辛烷磺酸鈉購(gòu)自ACROS公司，乙腈為色譜純（Fisher），水為去離子雙蒸水，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3微透析探針植入手術(shù)

采用1.5％的戊巴比妥鈉溶液，按照44 mg/Kg的劑量對(duì)大鼠實(shí)施麻醉。動(dòng)物麻醉后固定在大鼠腦立體定位儀上，用自制恒溫墊維持大鼠體溫為37μl。以前囟點(diǎn)作為坐標(biāo)原點(diǎn)，參照解剖圖譜確定下丘神經(jīng)核團(tuán)的位置（前囟后= 8.8mm；左右= 2.0mm；深度= 3.5mm）。在顱骨表面打孔，將微透析探針（MD-2200，探針尖端直徑2 mm，BAS）植入左側(cè)海馬，并用骨釘和牙科水泥進(jìn)行固定。術(shù)后將大鼠放入清醒裝置動(dòng)物轉(zhuǎn)盤中。術(shù)后恢復(fù)24小時(shí)后，進(jìn)行微透析取樣，控制流速為3 μL /min。試驗(yàn)結(jié)束后，以過量注射戊巴比妥鈉的方式處死大鼠。通過微透析探針注入甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色，進(jìn)行連續(xù)腦切片以確認(rèn)微透析探針植入的位置。

1.4微透析及多巴胺檢測(cè)

多巴胺的檢測(cè)采用微柱高效液相電化學(xué)檢測(cè)方法，檢測(cè)裝置為L(zhǎng)B－1型微量色譜泵（1－999 μL/ min，北京星達(dá)公司）；電化學(xué)檢測(cè)器為EG&G 174A極譜分析儀（美國(guó)），檢測(cè)池為L(zhǎng)C－4C型安培檢測(cè)池（日本），工作電極為玻碳電極（6mm），膜厚15 μL，有效池體積約為0.42 μL；Ag/AgCl為參比電極，不銹鋼為輔助電極，工作電壓設(shè)為+0.75V。

1.5數(shù)據(jù)分析

透析液中多巴胺的水平（χ±S）用相對(duì)于基礎(chǔ)值的百分比來(lái)表示。統(tǒng)計(jì)分析方法使用重復(fù)測(cè)定的雙因素方差分析（ANOVA）并以腹腔注射藥物的處理?xiàng)l件作為主要影響因素。P＜0.05認(rèn)為差異具有顯著性（雙尾法）。

2　結(jié)果

2.1耳鳴動(dòng)物模型下丘透析液多巴胺（DA）水平變化

下丘內(nèi)多巴胺的基礎(chǔ)值濃度分別是18±2.1 fmol/5 μl（n = 16）。水楊酸鈉（350 mg/kg i.p.，n = 8）顯著性地降低下丘DA水平，大約3小時(shí)后下丘DA降至最低，達(dá)到基礎(chǔ)值的49±9％，然后緩慢的升高，大約5小時(shí)后恢復(fù)到基線水平。對(duì)照組（n = 8），生理鹽水并未引起任何顯著性的改變。雙因素方差分析顯示水楊酸鈉和生理鹽水這兩種處理因素之間差異具有顯著性意義F0.05（1，14）= 6.117，P = 0.043），組內(nèi)時(shí)間因素之間的差異具有顯著性意義F0.05（19，152）= 46.842，P＜0.000001），時(shí)間和處理因素的交互效應(yīng)仍具顯著性意義F0.05（19，152）= 29.654，P＜0.000001）。

圖1　水楊酸鈉對(duì)下丘DA水平的影響Fig.1 The effect of salicylate on the dopamine in inferior colliculus

黑色方塊點(diǎn)線代表水楊酸鈉組多巴胺的變化（n=8），紅色圓點(diǎn)線圖代表對(duì)照組多巴胺的變化（n= 8）。箭頭顯示開始給予水楊酸鈉腹腔注射的時(shí)間。注射藥物前取2個(gè)樣品作為基礎(chǔ)值。腹腔注射水楊酸鈉引起大鼠下丘多巴胺水平顯著性降低，而腹腔注射生理鹽水后多巴胺水平無(wú)明顯變化（P＜0.000001）。

2.2甲苯胺藍(lán)染色組織切片顯示探針植入的位置（圖2）

圖2　微透析探針植入下丘的組織切片F(xiàn)ig.2 The tissue slices with implanted microdialysis probes

3　討論

利用微透析這種活體、動(dòng)態(tài)、連續(xù)的生化取樣技術(shù)研究水楊酸鈉引起大鼠耳鳴病理過程中下丘這一重要聽覺中樞神經(jīng)核團(tuán)神經(jīng)遞質(zhì)的變化對(duì)于闡明耳鳴神經(jīng)生理學(xué)機(jī)制具有重要的生物學(xué)意義。微透析技術(shù)一改先處死動(dòng)物，再將組織勻漿后取樣的傳統(tǒng)方法，使以往一籌莫展的活體動(dòng)態(tài)生化分析成為可能，特別是該技術(shù)可以在基本不破壞生物體內(nèi)環(huán)境的基礎(chǔ)上專門從局部神經(jīng)核團(tuán)中提取出具有重要生物學(xué)意義的細(xì)胞外液進(jìn)行檢測(cè)，更是傳統(tǒng)方法望塵莫及的，更能真實(shí)地反映出在水楊酸鈉導(dǎo)致的耳鳴過程中下丘內(nèi)多巴胺水平的變化。

本研究利用微透析技術(shù)結(jié)合高效液相電化學(xué)分析方法檢測(cè)到下丘神經(jīng)核團(tuán)內(nèi)多巴胺的基礎(chǔ)生理水平為18±2.1 fmol/5 μl（n = 16），與既往文獻(xiàn)結(jié)果大致相符。腹腔注射水楊酸鈉（350 mg/kg i.p.，n =8）引起下丘多巴胺水平顯著性地降低，大約3小時(shí)后下丘多巴胺降至最低，達(dá)到基礎(chǔ)值的49±9％，然后緩慢的升高，大約5小時(shí)后恢復(fù)到基線水平。而生理鹽水對(duì)照組并未引起任何顯著性的改變。因此得出初步的結(jié)論下丘內(nèi)多巴胺水平的顯著性降低可能與水楊酸鈉所誘導(dǎo)的耳鳴產(chǎn)生有關(guān)。既往有學(xué)者研究顯示噪聲刺激下耳蝸內(nèi)多巴胺因消耗其含量是降低的［4］。還有研究顯示長(zhǎng)時(shí)間強(qiáng)噪聲暴露下大鼠腦內(nèi)多巴胺的含量也是降低的［5］。新進(jìn)研究表明多巴胺能通路可能參與了耳鳴情感調(diào)控，多巴胺能藥物能提高丘腦感覺信號(hào)放電，同時(shí)在耳蝸多巴胺有抑制作用，可能參與早期耳鳴形成［6］。因此已經(jīng)有臨床實(shí)驗(yàn)證明多巴胺受體激動(dòng)劑普拉克索可以有效治療老年性耳聾所伴有的神經(jīng)性耳鳴［7］。

隨著對(duì)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)以及受體在耳鳴的發(fā)病機(jī)制中的作用不斷深入研究，相信一定為耳鳴的治療提供更精準(zhǔn)的藥物作用靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

1石勇兵.耳鳴患者的非聽覺問題.中華耳科學(xué)雜志.2007，5（3）：225-232.Shi yongbing.Non- auditory disorder s in tinnitus patients.Chinese Journal of Otology，2007；5（3）：225-232.

2Ffytche DH，Wible CG.From tones in tinnitus to sensed social interaction in schizophrenia:how understanding cortical organization can inform the study of hallucinations and psychosis.Schizophr Bull.2014；40（suppl 4）:305-316.

3Salmas RE，Yurtsever M，Durdagi S.Atomistic Molecular Dynamic Simulations of Typical and Atypical Anti-psychotic Drugs at the Dopamine D2 Receptor（D2R）Elucidates Their Inhibition Mechanism.J Biomol Struct Dyn.2016；29（2）:1-37.

4Lendvai B，Halmos GB，Polony G，Kapocsi J，Horváth T，Aller M，Sylvester Vizi E，Zelles T.Chemical neuroprotection in the cochlea:the modulation of dopamine release from lateral olivocochlear efferents.Neurochem Int.2011；59（2）：150-158.

5Fyk-Kolodziej BE，Shimano T，Gafoor D，Mirza N，Griffith RD，Gong TW，Holt AG.Dopamine in the auditory brainstem and midbrain:co-localization with amino acid neurotransmitters and gene expression following cochlear trauma.Front Neuroanat.2015；22 （9）：88-93.

6Langguth B，Elgoyhen AB.Current pharmacological treatments for tin.nitus.Expert Opin Pharmacother，2012；13（17）:2495-2509.

7Sziklai I1，Szilvássy J，Szilvássy Z.Tinnitus control by dopamine agonist pramipexole in presbycusis patients:a randomized，placebo-controlled，double-blind study.Laryngoscope.2011；121（4）：888-893.

Effects of salicylate on dopamine levels in rat inferior colliculus

LIU Junxiu1，LIU YIjun3，MAO Lanqun2，LI Xuepei1，MA Furong1
1Department of Otorhinolaryngology，Peking University Third Hospital，Beijing，100191，China
2Institue of Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Beijing，100190，China
3 Emergency Department，Huaxin Hospital，Beijing，100016，China
Corresponding author:MA FurongEmail:furongma@126.com

【Abstract】Objective To investigate dopamine level changes in the inferior colliculus induced by salicylate and the role of dopamine in the mechanisms of tinnitus.Methods In an animal model of salicylate-induced tinnitus，we employed microdialysis combined with electrochemical methodologies to monitor changes of dopamine in rat inferior colliculus.Results Salicylate produced significant decrease in dopamine levels in the inferior colliculus，to a minimum of 49±9％of baseline around 3 h post injection，followed by a return to the baseline by the end of the fifth hour.In contrast，saline did not produce any clear changes.Conclusion The decrease of dopamine in the inferior colliculus may be involved in the generation of tinnitus.Our in vivo data provide direct evidence of the important roles the dopaminergic system plays in the generation of tinnitus.

【Keywords】sodium salicylate，tinnitus，inferior colliculus，dopamine，microdialysis，high performance liquid chromatography

【中圖分類號(hào)】R764.45

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1672-2922（2016）02-167-3

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.008

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30500556、21372020）和北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（7082100、7112144）聯(lián)合資助

作者簡(jiǎn)介：劉俊秀，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：耳科學(xué)、鼻科學(xué)。

通訊作者：馬芙蓉，Email：furongma@163.com

收稿日期：（2016-03-24）