寶東艷 胡真真 李 芳 羅 啟 崔 紅 張 琳
(錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,遼寧 錦州 121001)
葛根素對卡那霉素耳中毒小鼠耳蝸核因子-κB p50活性的影響
寶東艷胡真真李芳羅啟崔紅張琳
(錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,遼寧錦州121001)
〔摘要〕目的觀察葛根素對卡那霉素(KM)耳中毒小鼠耳蝸核因子(NF)-κB p50活性的影響,探討葛根素對KM耳毒性發(fā)揮防護作用的機制。方法BALB/c小鼠隨機分成四組:正常對照組,KM組,KM+葛根素組,葛根素組,各組小鼠于用藥前及停藥后分別測試聽腦干反應(ABR)以進行正常BALB/c小鼠的篩選及聽力損傷后聽閾的測定。停藥后測試完ABR通過Western印跡檢測各組NF-κB p50的表達水平。結果KM組連續(xù)用藥14 d后,不同頻率的ABR閾值和NF-κB p50的表達水平明顯提高,而且與正常對照組比較差異顯著(P<0.01);KM+葛根素組雖然用藥后不同頻率的ABR閾值和NF-κB p50的表達水平也比正常對照組高,但較KM組明顯降低;正常對照組和葛根素組在整個用藥期間不同頻率的ABR閾值和NF-κB p50的表達水平無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論NF-κB p50參與了KM的耳毒性,葛根素通過下調NF-κB p50進而拮抗了KM的耳毒性。
〔關鍵詞〕葛根素;卡那霉素;耳蝸;核因子(NF)-κB
卡那霉素(KM)有很強的耳毒性,所以目前KM的應用受到一定的限制,用藥物有效拮抗KM的耳毒性越來越為人們所重視。葛根素為葛根中提取的一種異黃酮類化合物。已有報道通過體外培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn),葛根素對KM培養(yǎng)后的小鼠毛細胞的損傷有明顯拮抗效應〔1〕。也有報道稱,葛根素注射液對慶大霉素所致的大鼠耳蝸毒性有防護作用〔2〕。葛根素對在體小鼠應用KM產生的耳毒性中的作用與核因子(NF)-κB的關系還鮮見報道。本實驗通過制備KM耳中毒模型,結合聽腦干反應觀察葛根素對KM耳中毒的拮抗作用,同時應用蛋白質印跡技術探討葛根素發(fā)揮作用是否與NF-κB有關。
1材料與方法
1.1實驗動物BALB/c小鼠40只,雄性,4周齡,體重25~30 g,耳廓反應靈敏,由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供,許可證號:SYXK(遼)2004-0029。
1.2主要試劑和儀器硫酸卡那霉素粉劑購自美國Ameresco公司。該粉劑用生理鹽水溶解,根據(jù)動物數(shù)量和體重每日新鮮配制使用。葛根素注射液購自康普藥業(yè)股份有限公司,批號H20043980。兔抗NF-κB p50多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,β-actin購自博士德生物工程有限公司。Smart EP&OAE聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)購自美國智聽公司。
1.3方法
1.3.1實驗分組及小鼠耳毒模型的制備BALB/c小鼠隨機分成四組:KM組:皮下注射新鮮配制KM 750 mg/kg,2次/d;KM+葛根素組:皮下注射KM 750 mg/kg,2次/d,同時每日腹腔注射葛根素200 mg/kg;葛根素組:每日腹腔注射葛根素200 mg/kg;正常對照組:每日腹腔注射等量生理鹽水。各組動物均連續(xù)注射2 w,用藥期間每天監(jiān)測體重以調整藥量。
1.3.2ABR測試各組小鼠于用藥前及停藥后分別測試ABR。小鼠用1%戊巴比妥鈉100 mg/kg經(jīng)腹腔麻醉后,將電極的正極置于小鼠顱頂正中皮下,負極置于給聲側耳廓后下,接地電極置于對側耳廓后下,操作在隔音屏蔽室內進行并注意動物保溫。應用Smart EP&OAE聽覺誘發(fā)電位一耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)給予短純音刺激,選取8 kHz、12 kHz、24 kHz 3個頻率分別進行測試并記錄ABR閾值(聽閾),重復率39.1次/秒,帶通濾波100~3 000 Hz,疊加1 024次,掃描時程16.0 ms。聲刺激強度從95 dB開始,以5 dB逐次遞減,聽閾判定以剛出現(xiàn)ABRⅠ波為準并至少重復2次。測試在隔音屏蔽室內進行。用藥前及停藥后分別測試ABR以進行正常BALB/c小鼠的篩選及聽力損傷后聽閾的測定。
1.3.3Western印跡停藥后測試完ABR后,立即斷頭處死,速取聽泡,充分暴露耳蝸后,取小鼠耳蝸組織,置于液氮中,冷凍后放入-80℃冰箱備用。每組取3只小鼠的耳蝸,剪碎,PBS洗3遍,每份加入含PMSF 1 mmol/L的RIPA裂解液后勻漿,以上步驟在冰上操作。將勻漿液倒入離心管中,4℃,離心5 min后取上清,加入5倍上樣緩沖液后,離心,渦旋,95℃變性5 min。將處理好的樣品用SDS聚丙烯凝膠電泳分離,電轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1h,分別加入NF-κB p50 (1∶300),β-actin一抗,4℃孵育過夜,分別加入二抗,室溫搖床上孵育90 min,ECL法發(fā)光顯影。顯影的結果經(jīng)GE Image Quent 350 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)掃描后,用Image進行光密度分析,密度分析結果經(jīng)內參蛋白矯正。
1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。
2結果
2.1ABR測試KM組連續(xù)用藥14 d后,不同頻率的ABR閾值明顯提高,而且與正常對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);KM+葛根素組雖然用藥后不同頻率的ABR閾值也比正常對照組高,但較KM組明顯降低;正常對照組和葛根素組在整個用藥期間不同頻率的ABR閾值無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。
2.2Western印跡NF-κB p50蛋白的表達圖1可見,KM組(1.43±0.14)與正常對照組(0.84±0.11)比較,NF-κB p50的表達水平明顯升高。KM+葛根素組(0.97±0.15)與正常對照組比較NF-κB p50的表達水平升高,但較KM組低。葛根素組(0.81±0.13)和正常對照組差異不顯著。
表1 不同頻率的腦干聽覺閾值
與給藥前比較:1)P<0.01;與KM組比較:2)P<0.01
1:正常對照組;2:KM組;3:KM+葛根素組;4:葛根素組圖1 NF-κB p50蛋白在各組的表達
3討論
KM等氨基甙類抗生素(AmAn)耳中毒后可引起耳蝸結構的破壞,具有損害內耳的副作用,目前對這類抗生素所引起的耳聾尚無較好的防治辦法。
NF-κB的活化調節(jié)著凋亡及對炎性刺激和氧化應激的反應。NF-κB的過度表達可能導致變態(tài)反應性疾病,血管疾病,缺血再灌注性神經(jīng)損傷等。在內耳中,NF-κB的作用還沒有完全清楚,因為NF-κB的活化可能對細胞有保護作用或者毒性作用〔3〕。一方面,Jiang等〔4〕報道NF-κB的活化對KM誘導的聽力損傷有保護作用。2004年就有人提出內耳毛細胞發(fā)揮正常功能需要NF-κB〔5〕。另一方面,耳毒性刺激,例如噪聲或耳毒性藥物都能誘導NF-κB的活化,導致耳蝸側壁產生很多ROS,從而造成聽力損傷〔6,7〕。NO活化NF-κB,Caspase-1,進而產生ROS,造成聽力損傷;茶多酚的主要成分(EGCG)則通過抑制NF-κB和Caspase,保護了聽力〔8〕。順鉑誘導促炎因子的產生,通過上調NF-κB的活性產生耳毒性〔9〕。順鉑能活化NF-κB,進而介導了順鉑誘導的聽覺細胞的凋亡,而同時應用NF-κB抑制劑后減弱了順鉑誘導的凋亡〔10〕。由上可知,NF-κB在聽力中的作用還有爭議。本實驗通過檢測聽功能及NF-κB p50水平發(fā)現(xiàn),聽功能下降的同時NF-κB p50的表達增多,提示NF-κB p50 表達增多能損傷聽力,與Kim等〔8〕的報道一致。
本實驗室的前期工作表明〔11,12〕,正常豚鼠耳蝸多種細胞的胞質中存在NF-κB p65和p50,注射慶大霉素后,NF-κB被誘導激活,進而造成聽力損害,丹參通過顯著抑制KM所致NF-κB的高活性,從而有效拮抗KM的耳毒性。本實驗中發(fā)現(xiàn)KM造成了聽力損傷,可能通過活化NF-κB p50進而損傷了聽力。
葛根素為葛根中提取的一種異黃酮類化合物,對突發(fā)性耳聾有明顯的療效,能有效地擴張血管,促進內耳的微循環(huán)〔13〕。通過體外培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn),葛根素對KM培養(yǎng)后的小鼠毛細胞的損傷有明顯拮抗效應〔1〕。另外葛根素注射液對慶大霉素所致的大鼠耳蝸毒性有防護作用〔2〕。劉衛(wèi)紅等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)耳后注射葛根素注射液聯(lián)合聲頻共振對早期老年性聾有較好治療作用,并能延緩老年性聾,對耳鳴也有很好療效。本實驗證明了葛根素對KM耳毒性的拮抗作用。
本實驗推測應用KM后,NF-κB p50活化,進而產生了ROS,誘導了毛細胞的凋亡,聽功能下降,而葛根素通過抑制NF-κB p50,抑制了毛細胞的凋亡,進而保護了毛細胞,聽功能較KM組有所改善。葛根素對KM耳毒性的拮抗作用可能有很多因子參與其中,NF-κB p50 只是其中一個,葛根素發(fā)揮作用的具體機制需要進一步探討。
4參考文獻
1董楊,王靜,施建蓉.葛根素對慶大霉素所致小鼠耳蝸毛細胞損傷的拮抗效應〔J〕.中國中西醫(yī)結合耳鼻咽喉科雜志,2008;16(6):401-3.
2趙慕蘭,姜學鈞.葛根素注射液拮抗慶大霉素耳蝸毒性的實驗研究〔J〕.醫(yī)藥導報,2009;28(4):452-3.
3Yamamoto H,Omelchenko I,Shi X,etal.The influence of NF-κB signal transduction pathways on the murine inner ear by acoustic overstimulation〔J〕.J Neurosci Res,2009;87(8):1832-40.
4Jiang H,Sha SH,Schacht J.NF-κB pathway protects cochlear hair cells from aminoglycoside-induced ototoxicity〔J〕.J Neurosci Res,2005;79(5):644-51.
5Shishodia SBB Aggarwal.Nuclear factor-κB:a friend or a foe in cancer〔J〕.Biochem Pharmacol,2004;68(6):1071-80.
6Watanabe KI,Inai S,Jinnouchi K,etal.Nuclear-factor kappa B (NF-κB)-inducible nitric oxide synthase (iNOS/NOS Ⅱ) pathway damages the stria vascularis in cisplatin-treated mice〔J〕.Anticancer Rep,2002;22(6C):4081-5.
7Masuda M,Nagashima R,Kanzaki S,etal.Nuclear factor-kappa B nuclear translocation in the cochlea of mice following acoustic overstimulation〔J〕.Brain Res,2006;1068(1):237-47.
8Kim SJ,Lee JH,Kim BS,etal.Epigallocatechin-3-gallate protects against NO-induced ototoxicity through the regulation of caspase-1,Caspase-3,and NF-κB activation〔J〕.PLoS One,2012;7(9):e43967.
9So H,Kim H,Lee JH,etal.Cisplatin cytotoxicity of auditory cells requires secretions of proinflammatory cytokines via activation of ERK and NF-κB〔J〕.J Assoc Res Otolaryngol,2007;8(3):338-55.
10Chung WH,Boo SH,Chung MK,etal.Proapoptotic effects of NF-κB on cisplatin-induced cell death in auditory cell line〔J〕.Acta Otolaryngol,2008;128(10):1063-70.
11寶東艷,王愛梅,李偉紅,等.丹參對慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸NF-κB活性的影響〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2009;19(17):2601-6.
12寶東艷,王愛梅,李偉紅,等.丹參對慶大霉素致豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)毒性的拮抗作用〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(4):873-5.
13劉健民,馬莉,何偉平.葛根素治療突發(fā)性聾的療效觀察〔J〕.第一軍醫(yī)大學學報,2002;22(11):1044-5.
14劉衛(wèi)紅,姚琦,王陳榮,等.葛根素注射液耳后注射聯(lián)合聲頻共振治療老年性聾療效觀察〔J〕.新中醫(yī),2013;45(3):110-3.
〔2014-12-31修回〕
(編輯苑云杰/曹夢園)
基金項目:2014年度遼寧省科技廳自然科學基金(2014022026);2013年遼寧省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310160015);遼寧醫(yī)學院校長基金項目-奧鴻博澤基金-大學生創(chuàng)新課題(2013D21)
〔中圖分類號〕R764.5
〔文獻標識碼〕A
〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2574-03;
doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.003
第一作者:寶東艷(1980-),女,在讀博士,講師,主要從事聽覺生理研究。