甘草次酸對(duì)哮喘大鼠肺泡灌洗液白細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清相關(guān)炎癥因子的影響

林香花　馮可青　鄭素歌　錢(qián)皓瑜　陳卓昌

(河南省人民醫(yī)院呼吸科，河南　鄭州　450000)

甘草次酸對(duì)哮喘大鼠肺泡灌洗液白細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清相關(guān)炎癥因子的影響

林香花馮可青鄭素歌錢(qián)皓瑜陳卓昌

(河南省人民醫(yī)院呼吸科，河南鄭州450000)

〔摘要〕目的探討甘草次酸對(duì)哮喘大鼠肺泡灌洗液(BALF)白細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清相關(guān)炎癥因子的影響。方法選擇健康清潔級(jí)雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為哮喘模型組、甘草次酸組及正常對(duì)照組各10只。通過(guò)向哮喘模型組、甘草次酸組大鼠腹腔注射雞卵清蛋白(OVA)+氫氧化鋁凝膠致敏，并采用OVA霧化吸入激發(fā)形成哮喘模型。每次激發(fā)前2 h給予甘草次酸組大鼠10 mg/100 mg甘草次酸灌胃，哮喘模型組與正常對(duì)照組給予0.9%生理鹽水0.1 ml/100 mg灌胃。最后一次激發(fā)完成后24 h內(nèi)采集血清，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定三組血清免疫球蛋白(Ig)E、白細(xì)胞介素(IL)-13、IL-18、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平，收集三組BALF對(duì)細(xì)胞沉渣進(jìn)行瑞氏染色，并按照白細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果根據(jù)臨床癥狀及病理檢查結(jié)果判定哮喘模型組、甘草次酸組造模成功；甘草次酸組較哮喘模型組中性粒細(xì)胞表達(dá)相對(duì)上升，但較正常對(duì)照組明顯上升，而淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)較哮喘模型組相對(duì)降低，但較正常對(duì)照組明顯上升(均P<0.05)；哮喘模型組血清IgE、IL-13、TNF-α表達(dá)水平最高，甘草次酸組居中，正常對(duì)照組最低(P<0.05)，而正常對(duì)照組IL-18表達(dá)水平最高，其次是甘草次酸組，哮喘模型組最低(P<0.05)。結(jié)論甘草次酸通過(guò)選擇性誘導(dǎo)成熟T淋巴細(xì)胞凋亡，減少嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生，抑制IgE、IL-13、TNF-α炎癥因子表達(dá)，有效減輕哮喘大鼠氣道炎癥的產(chǎn)生，發(fā)揮平喘功效。

〔關(guān)鍵詞〕甘草次酸；哮喘模型；免疫球蛋白E；白細(xì)胞

研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素(IL)-18和腫瘤壞死因子(TNF)-α介導(dǎo)下出現(xiàn)T細(xì)胞亞群功能失調(diào)，并引起IgE等炎癥因子異常是導(dǎo)致哮喘發(fā)生的重要原因〔1〕。近年來(lái)，甘草治療哮喘的療效研究不斷深入〔2〕，其中甘草次酸分子結(jié)構(gòu)相似于甾體激素，具有抗感染、抗?jié)?、抗病毒等功效。本研究旨在探討甘草次酸治療哮喘的臨床療效及其機(jī)制。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物選擇由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供的8周齡健康清潔級(jí)雄性SD大鼠30只，體重150～200 g，合格證號(hào)：2012-0014。 普通飲食喂養(yǎng)，全自動(dòng)供水，喂養(yǎng)室溫控制在(22±2)℃，濕度控制在50%～70%，適度光照，通風(fēng)及潔凈程度良好。

1.2主要藥品與試劑純度≥98%的甘草次酸(西安天行健天然生物制品集團(tuán)公司生產(chǎn))；氫氧化鋁凝膠(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn))；雞卵清蛋白(OVA，美國(guó)sigma公司生產(chǎn))；大鼠免疫球蛋白(Ig)E、IL-13、IL-18 及TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn))。

1.3主要試驗(yàn)儀器美國(guó)BioTek公司生產(chǎn)的EXL800型酶標(biāo)儀；美國(guó)Biofiige stratos公司生產(chǎn)的Sorvall低溫離心機(jī)；南京道芬中美合資有限公司生產(chǎn)的S-888E型超聲霧化機(jī)；中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司生產(chǎn)的R-911型全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀。

1.4造模方法〔3〕將30只SD大鼠隨機(jī)分為哮喘模型組、甘草次酸組及正常對(duì)照組各10只。哮喘模型組與甘草次酸組大鼠均在試驗(yàn)第1天及第8天腹腔注射OVA 1 mg+氫氧化鋁凝膠100 mg混懸液1 ml致敏，正常對(duì)照組同一時(shí)點(diǎn)給予等量0.9%生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。第9天開(kāi)始，每天將哮喘模型組與甘草次酸組大鼠放入有霧化器的有機(jī)玻璃盒中，分別給予1 mg/ml OVA霧化吸入30 min激發(fā)致敏，連續(xù)7 d，參考哮喘模型成功評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)〔4〕，評(píng)判哮喘模型造模結(jié)局。正常對(duì)照組使用0.9%生理鹽水代替進(jìn)行霧化吸入30 min/d。每次激發(fā)前2 h給予甘草次酸組大鼠10 mg/100 mg甘草次酸灌胃，哮喘模型組與正常對(duì)照組給予0.9%生理鹽水0.1 ml/100 mg灌胃。

1.5指標(biāo)檢測(cè)最后一次激發(fā)完成后24 h，麻醉大鼠并采集腹主動(dòng)脈血液，2 000 r/min離心10 min，取上層血清，采用ELISA法測(cè)定血清IgE、IL-13、IL-18、TNF-α水平。采集完畢后處死大鼠，在頸部正中區(qū)域分離氣管并插入留置針，使用1 ml生理鹽水反復(fù)灌洗，每次灌洗后即刻進(jìn)行回吸，收集肺泡灌洗液(BALF)，共進(jìn)行8次，之后對(duì)BALF 1 000 r/min離心10 min，對(duì)細(xì)胞沉渣進(jìn)行瑞氏染色并按照白細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1哮喘模型造模結(jié)果造模完成后，與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組、甘草次酸組的大鼠呼吸頻率顯著增加(均>20%)，所有大鼠經(jīng)過(guò)哮喘激發(fā)30 min左右均出現(xiàn)不同程度的煩躁不安、腹肌抽搐、大小便失禁、毛發(fā)豎起、活動(dòng)減少、飲食減少、口鼻發(fā)紺等癥狀。后期病理切片檢測(cè)兩組大鼠支氣管壁周?chē)霈F(xiàn)大量的淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并出現(xiàn)支氣管氣道上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞增多等現(xiàn)象；同時(shí)，兩組大鼠BALF中IgE水平明顯上升，沉渣嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(EOS)增多。判定哮喘模型組、甘草次酸組造模成功。

2.2三組SD大鼠BALF白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)比較三組SD大鼠BALF中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞含量差異顯著(P<0.05)，其中哮喘模型組大鼠淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞含量最高；甘草次酸組較哮喘模型組相對(duì)降低，但較正常對(duì)照組仍然較高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1三組SD大鼠BALF白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)比較

組別淋巴細(xì)胞中性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞甘草次酸組31.15±3.201)2)60.75±3.051)2)7.35±0.801)2)哮喘模型組55.20±6.251)72.30±5.051)12.30±4.151)正常對(duì)照組22.50±2.1548.15±4.203.30±0.55F值18.2525.1712.19P值0.010.010.01

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05；與哮喘模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.3三組IgE、IL-3、IL-18、TNF-α表達(dá)水平比較三組IgE、IL-13、IL-18、TNF-α水平差異顯著(P<0.05)，其中哮喘模型組IgE、IL-13、TNF-α表達(dá)水平最高，甘草次酸組居中，正常對(duì)照組最低(P<0.05)，而正常對(duì)照組IL-18表達(dá)水平最高，其次是甘草次酸組，哮喘模型組最低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　三組IgE、IL-13、IL-18、TNF-α

3討論

研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)T細(xì)胞亞群功能失調(diào)以及IL、TNF-α等炎癥因子表達(dá)水平異常是引發(fā)患者哮喘的重要因素〔5〕。輔助性T細(xì)胞(Th)是重要的T細(xì)胞亞群，根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子的不同可分為T(mén)h0、Th1、Th2 和Th3 4個(gè)亞型。其中Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、干擾素(IFN)-γ、IFN-α、TNF-α等；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，主要功能為刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生IgG和IgE抗體，與體液免疫有關(guān)〔6〕。機(jī)體正常情況下，Th1和Th2細(xì)胞處于相對(duì)平衡狀態(tài)，共同維護(hù)機(jī)體正常的細(xì)胞及體液免疫，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，Th1和Th2細(xì)胞出現(xiàn)極化偏向，引起Th1/Th2比例失調(diào)，Th2細(xì)胞的增加促進(jìn)了B細(xì)胞產(chǎn)生大量IgE和分泌炎癥性細(xì)胞因子，進(jìn)一步刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞等產(chǎn)生白三烯、內(nèi)皮素、前列腺素和血栓素A2等多種炎癥介素，隨著上述介質(zhì)含量的上升可以引發(fā)支氣管平滑肌攣縮，毛細(xì)血管擴(kuò)張，腺體分泌增多，形成Th1型和Th2型相關(guān)變態(tài)反應(yīng)，同時(shí)促使神經(jīng)源性炎癥的產(chǎn)生〔7〕。同時(shí)，B細(xì)胞產(chǎn)生的大量IgE能與肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，引起上述細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎性介質(zhì)，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性、黏液分泌增強(qiáng)并導(dǎo)致靜脈通透性增高〔8〕。血管通透性增加以及氣道黏膜水腫的產(chǎn)生，從另一方面導(dǎo)致哮喘發(fā)作〔9〕。另外，研究發(fā)現(xiàn)〔10〕炎癥因子IL-13可通過(guò)上調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)對(duì)哮喘發(fā)病時(shí)異常的免疫過(guò)程進(jìn)行正向調(diào)節(jié)，而IL-18作為機(jī)體抵抗嚴(yán)重感染所必需的重要細(xì)胞因子，通過(guò)促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為T(mén)h1細(xì)胞，產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，并下調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)，可發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)哮喘免疫應(yīng)答的作用。

甘草次酸是從甘草中提取的生物活性物質(zhì)，屬于五環(huán)三萜類(lèi)化合物。本研究提示免疫系統(tǒng)功能失調(diào)與血清炎癥因子對(duì)哮喘的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。而且甘草次酸可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫功能來(lái)改善大鼠的哮喘癥狀。分析原因可能為：(1)甘草次酸具有類(lèi)似甾體激素的分子結(jié)構(gòu)，通過(guò)抑制甾體激素代謝失活酶，進(jìn)一步提高內(nèi)源性和外源性糖皮質(zhì)激素的活性，同時(shí)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)糖皮質(zhì)激素受體，發(fā)揮部分激動(dòng)拮抗劑特性〔10〕；(2)甘草次酸具有選擇性誘導(dǎo)成熟T淋巴細(xì)胞凋亡的功能，在一定程度上對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞亞群失衡進(jìn)行了糾正，并通過(guò)抑制IgG、IgE抗體的生成，多靶點(diǎn)對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)進(jìn)行抑制，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)生成進(jìn)行抑制的作用〔11〕?？傊?，甘草次酸通過(guò)選擇性誘導(dǎo)成熟T淋巴細(xì)胞凋亡，減少嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生，抑制IgE、IL-13、TNF-α炎癥因子表達(dá)，有效減輕哮喘大鼠氣道炎癥的產(chǎn)生，發(fā)揮平喘功效，對(duì)臨床應(yīng)用具有參考價(jià)值。

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〔2015-07-12修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：陳卓昌(1965-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事支氣管哮喘方面的研究。

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R56

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)11-2613-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.020

第一作者：林香花(1979-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事支氣管哮喘方面的研究。