于東樹 陳金金 熊焱

摘 要：菌落總數(shù)是判定食品新鮮程度和微生物污染程度的質(zhì)量安全指標(biāo)，用于食品質(zhì)量分析及衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)。對(duì)菌落總數(shù)測(cè)定實(shí)施有效控制，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免誤判。

關(guān)鍵詞：菌落總數(shù)測(cè)定；影響因素；分析

菌落總數(shù)是反映食品衛(wèi)生狀況的質(zhì)量安全指標(biāo)，用于判定食品的新鮮程度及微生物污染程度，結(jié)合大腸菌群及病原菌的檢測(cè)，對(duì)食品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)。菌落總數(shù)測(cè)定在某種程度上具有相對(duì)的不可比性，必須對(duì)測(cè)定過程實(shí)施有效控制，以保證檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)、公正、準(zhǔn)確。

一、菌落總數(shù)測(cè)定概述

（一）菌落與菌落總數(shù)

1）菌落：細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖而形成的能被肉眼識(shí)別的生長(zhǎng)物，它是由數(shù)以萬(wàn)計(jì)相同的微生物集合而成。當(dāng)樣品被稀釋到一定程度，與培養(yǎng)基混合，在一定培養(yǎng)條件下，每個(gè)能夠生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌細(xì)胞都可以在平板上形成一個(gè)可見的菌落。

2）菌落總數(shù)：食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等）培養(yǎng)后，所得每g（ml）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。由于一個(gè)菌落并不一定是一個(gè)細(xì)菌所生成，因此菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（CFU）表示為CFU/g（ml）。

（二）菌落總數(shù)測(cè)定方法

食品中菌落總數(shù)測(cè)定一般采用平板計(jì)數(shù)（CFU）法。即樣品25g（ml）+225ml稀釋液，均質(zhì)后進(jìn)行l(wèi)O倍遞增稀釋；選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，各取1ml接種于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度接種二個(gè)平板；加入平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻后培養(yǎng)；計(jì)算每個(gè)瓊脂平板上所生成的細(xì)菌菌落數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出每g（m1）樣品中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)CFU/g（ml）。

二、菌落總數(shù)測(cè)定中容易出現(xiàn)的問題

細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖受多種因素影響，故菌落總數(shù)測(cè)定在某種程度上具有相對(duì)的不可比性。以下問題均會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至造成測(cè)定結(jié)果錯(cuò)誤，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致誤判。

1）檢測(cè)人員：檢測(cè)技術(shù)不熟練或誤操作可影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性或誤判。2）檢測(cè)設(shè)備：檢測(cè)設(shè)備未進(jìn)行量值溯源，或未對(duì)校準(zhǔn)結(jié)果確認(rèn)、未實(shí)施期間核查，及未對(duì)檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行維護(hù)、清潔，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性或誤判。3）培養(yǎng)基和試劑：未進(jìn)行培養(yǎng)基、試劑及標(biāo)準(zhǔn)菌株的采購(gòu)驗(yàn)證，不能有效保證其質(zhì)量，或未按標(biāo)準(zhǔn)正確制備培養(yǎng)基和試劑，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性或誤判。4）檢測(cè)設(shè)施和環(huán)境：微生物實(shí)驗(yàn)室達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的潔凈度等級(jí)，或未及時(shí)進(jìn)行消毒滅菌和潔凈度檢測(cè)，造成檢測(cè)過程污染，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確甚至誤判。5）檢測(cè)過程：未嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作，采樣不具代表性及樣品污染，樣品稀釋誤差或接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)等過程的操作不當(dāng)均可導(dǎo)致檢測(cè)不準(zhǔn)確或誤判。

三、菌落總數(shù)測(cè)定中的質(zhì)量控制

食品微生物檢測(cè)是指按照一定的檢測(cè)程序和質(zhì)量控制措施，確定單位樣品中某種或某類微生物的數(shù)量或存在狀況。為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，重點(diǎn)應(yīng)做好以下環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制：

1）檢測(cè)人員：應(yīng)掌握一定的微生物學(xué)知識(shí)，經(jīng)設(shè)備操作、檢測(cè)技能、生物安全等專業(yè)知識(shí)培訓(xùn)?？捎靡阎獦悠窓z測(cè)及能力驗(yàn)證等方式定期對(duì)檢測(cè)人員的能力進(jìn)行考核評(píng)估。

2）設(shè)施和環(huán)境：微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合“無(wú)回路”原則；應(yīng)有安全警示標(biāo)識(shí)及特殊狀態(tài)（如“污染”、“消毒”、“檢修”等）的臨時(shí)標(biāo)識(shí)。應(yīng)定期對(duì)設(shè)施和環(huán)境進(jìn)行消毒滅菌，并無(wú)菌室空氣滅菌效果驗(yàn)證方法（沉降法）對(duì)滅菌效果進(jìn)行檢查驗(yàn)證和確認(rèn)。

3）檢測(cè)設(shè)備：檢測(cè)設(shè)備的配備與放置應(yīng)滿足檢測(cè)要求，定期進(jìn)行檢定/校準(zhǔn)，適時(shí)進(jìn)行期間核查、消毒滅菌，并按消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法對(duì)消毒滅菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

4）培養(yǎng)基和試劑：應(yīng)通過性能測(cè)試對(duì)培養(yǎng)基和試劑的采購(gòu)及制備進(jìn)行驗(yàn)證和質(zhì)量控制；培養(yǎng)基和試劑的配制應(yīng)符合培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證要求。

5）檢測(cè)樣品：樣品應(yīng)有代表性并按無(wú)菌操作采樣；采樣器具、容器應(yīng)經(jīng)消毒滅菌；送樣過程應(yīng)避免污染。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡快對(duì)樣品實(shí)施檢驗(yàn)，若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)采取必要的措施以保持樣品的原有狀態(tài)，以免微生物變化。

6） 檢測(cè)過程：檢測(cè)過程的質(zhì)量控制應(yīng)特別注重以下環(huán)節(jié)：

a.檢測(cè)器具、培養(yǎng)基及稀釋液：檢測(cè)器具必須洗滌干凈后完全滅菌，不得殘留有抑菌物質(zhì)；培養(yǎng)基和稀釋液應(yīng)高壓滅菌。可通過空白對(duì)照以判定器具、培養(yǎng)基或稀釋液是否污染。

b.樣品制備：制樣器具應(yīng)消毒滅菌，預(yù)包裝食品應(yīng)對(duì)外包裝消毒，避免樣品污染。冰凍樣品解凍時(shí)間不宜過長(zhǎng)，避免細(xì)菌增殖；稀釋液應(yīng)充分振搖均勻；吸取不同稀釋度樣品應(yīng)更換吸管，并避免吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)或吸管外部粘附檢液對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確性的影響。

c.接種：根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)或樣品污染情況選擇適宜的稀釋度，稀釋度過大菌落生長(zhǎng)稀少，稀釋度過小菌落生長(zhǎng)密度高，難以計(jì)數(shù)。傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46℃水浴內(nèi)保溫，溫度過高影響細(xì)菌生長(zhǎng)，過低瓊脂易凝固而不能與菌液充分混勻；培養(yǎng)基的量以15ml為宜，平板過厚影響觀察，太薄易于干裂。接種后應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，使菌落均勻分布，避免菌落蔓延生長(zhǎng)。檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min，以防止細(xì)菌死亡或繁殖及產(chǎn)生片狀菌落。為避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培養(yǎng)基混合的平板，于4℃環(huán)境中放置，以便計(jì)數(shù)時(shí)對(duì)照觀察。

可采用“夾心法”即在樣液上下各傾注一層瓊脂防止瓊脂和平皿之間形成水膜樣的蔓延菌落。

d.培養(yǎng)：應(yīng)適時(shí)對(duì)培養(yǎng)溫度進(jìn)行檢查，防止溫度過高菌落蔓延生長(zhǎng)；應(yīng)防止因通風(fēng)和空氣循環(huán)而造成的培養(yǎng)基太干，而影響細(xì)菌正常生長(zhǎng)。為保證細(xì)菌正常繁殖，培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過15%。

e.計(jì)數(shù)：到規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間后應(yīng)立即計(jì)數(shù)，如不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0～4℃保存，但不得超過24h。一般情況，同一稀釋度二個(gè)平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近；不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比，即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多，如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗(yàn)差錯(cuò)或可能因抑菌劑混入樣品中所致，均不可用作檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。在計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)采取多人同時(shí)進(jìn)行，以避免視覺疲勞造成的誤差。

GB/T27405-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品微生物檢測(cè)》對(duì)微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的管理、技術(shù)、過程控制、內(nèi)部質(zhì)量控制和外部質(zhì)量評(píng)估有明確的規(guī)定，檢測(cè)過程必須實(shí)施有效的質(zhì)量控制，以保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，避免誤判。