陳獻(xiàn)花, 方 麗, 李雪來, 余陳歡, 應(yīng)華忠(. 浙江省醫(yī)療器械檢驗(yàn)院, 浙江省醫(yī)療器械安全性評(píng)價(jià)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 3008; . 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 3003)

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偏苯三酸三辛酯對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制

陳獻(xiàn)花1, 方 麗1, 李雪來1, 余陳歡2, 應(yīng)華忠2
(1. 浙江省醫(yī)療器械檢驗(yàn)院, 浙江省醫(yī)療器械安全性評(píng)價(jià)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310018; 2. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310013)

[摘要]目的 研究偏苯三酸三辛酯(TOTM)的肝細(xì)胞毒性作用及其毒性機(jī)制。方法 將TOTM 0.062 5～1.0 mg/mL分別與HepG2、LO2、Hep1-6肝細(xì)胞作用48 h。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率并計(jì)算半抑制濃度(IC50)值; 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化; 采用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)含量; 采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 TOTM對(duì)肝細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，MTT檢測(cè)顯示TOTM對(duì)HepG2、LO2、Hep1-6肝細(xì)胞的IC50分別為1.74 mg/mL、0.34 mg/mL和0.23 mg/mL。隨著TOTM劑量的增加，TOTM能升高肝細(xì)胞上清中AST、ALT含量, 促進(jìn)LDH釋放和細(xì)胞凋亡。結(jié)論 TOTM對(duì)肝細(xì)胞具有一定的毒性作用。

[關(guān)鍵詞]偏苯三酸三辛酯; 肝細(xì)胞; 細(xì)胞凋亡

偏苯三酸三辛酯(TOTM)是目前常用的新型塑化劑之一，目前被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)耐熱和耐壓的輸注類醫(yī)療器械等產(chǎn)品[1]。現(xiàn)有文獻(xiàn)[2,3]報(bào)道，由于部分藥物、輔料的助溶作用，微量TOTM可從聚氯乙烯、硝酸纖維素等材料制成的輸液軟管中滲出并伴隨注射液進(jìn)入體內(nèi)。雖然TOTM較其他塑化劑具有生物體內(nèi)代謝快、毒性低、低浸出等優(yōu)點(diǎn)，但其潛在的遺傳和生殖毒性仍不可忽視[4]。肝臟是體內(nèi)最主要的藥物代謝器官，靜脈輸送藥物進(jìn)入體內(nèi)后大部分在肝臟代謝、分解。項(xiàng)目組前期研究顯示, 每日給小鼠尾靜脈注射100mg/kg, TOTM[歐洲化學(xué)品管理局(ECHA)標(biāo)示的無可見有害作用水平(NOAEL)劑量]可引起小鼠肝組織細(xì)胞脂質(zhì)堆積和部分細(xì)胞壞死，并可導(dǎo)致丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血脂等生化指標(biāo)升高。但目前關(guān)于TOTM對(duì)肝細(xì)胞的半數(shù)抑制劑量及其作用機(jī)制尚不清楚[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)TOTM的肝細(xì)胞毒性進(jìn)行深入評(píng)價(jià)，以完善TOTM的安全評(píng)估體系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

TOTM購自上海阿拉丁試劑有限公司; RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自杭州四季青生物制品有限公司; AST、ALT檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所; AnnexinV /PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)股份有限公司。FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。Thermo311二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱為美國熱電公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞

HepG2人肝癌細(xì)胞、LO2人正常肝細(xì)胞、Hep1-6小鼠肝癌細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2、LO2和Hep1-6細(xì)胞分別獨(dú)立培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中, 置 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及飽和濕度下細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶液消化、傳代，取狀態(tài)良好、增殖旺盛的細(xì)胞用于本試驗(yàn)。

1.4 TOTM供試樣品的制備

取TOTM 500 mL溶解在484 mL 二甲基亞砜(DMSO)中配制成 500 mg/mL的儲(chǔ)存液。將儲(chǔ)存液用培養(yǎng)基配制成不同濃度(即培養(yǎng)基中TOTM的終濃度為0.062 5 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)，其中DMSO的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于1‰。

1.5 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

選對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞, 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化、收集, 將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×104/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板, CO2孵育箱中培養(yǎng)12 h, 加入TOTM使其終濃度為0.062 5 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL。平行設(shè)置對(duì)照孔(不加藥)，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵育箱中培養(yǎng)48 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入5 mg/mL的MTT 10mL, 混勻, 繼續(xù)培養(yǎng)2 h, 棄去上清液，每孔加入100 mL DMSO，震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀于波長490 nm測(cè)每孔吸光度OD值，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.6 細(xì)胞凋亡率測(cè)定

將濃度為1×105/mL的LO2細(xì)胞, 接種于6孔板中。加TOTM至各孔(終濃度為0.34 mg/mL)。平行設(shè)置對(duì)照組, 藥物作用48 h, 收集、消化后，加 PBS, 800 r/min離心5 min 洗 2 次, 計(jì)數(shù); 稀釋成每毫升約1×105細(xì)胞, 轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞管, 加入Annexin V- FITC和Propidium Iodide各5 mL，混勻，室溫避光孵育 15 min，用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞凋亡率。

1.7 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取滅菌后的蓋玻片放入無菌6孔板中，接種LO2細(xì)胞，待細(xì)胞生長至70%時(shí)，棄去舊的培養(yǎng)液，將不同濃度的含藥培養(yǎng)液加到相應(yīng)的孔中，培養(yǎng)48 h后，取出蓋玻片，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.8 乳酸脫氫酶(LDH)、AST及ALT含量測(cè)定

調(diào)整為1.0×105/mL的LO2細(xì)胞懸液，于CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，加TOTM(終濃度為0.34 mg/mL)。平行設(shè)置對(duì)照組，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。按照試劑盒說明書，用酶標(biāo)儀測(cè)定LDH、AST及ALT含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，各組定量檢測(cè)數(shù)據(jù)以x-± s表示，組間比較用LSD 檢驗(yàn), P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOTM對(duì)肝細(xì)胞增殖的抑制作用

TOTM對(duì)HepG2、LO2、Hep1-6細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，并呈現(xiàn)量效關(guān)系(圖1)。經(jīng)計(jì)算，TOTM對(duì)HepG2、LO2、Hep1-6肝細(xì)胞的半抑制濃度 (IC50) 分別為1.74 mg/mL、0.34 mg/mL和0.23 mg/mL。提示Hep1-6小鼠肝癌細(xì)胞和LO2人正常肝細(xì)胞對(duì)TOTM相對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞較為敏感。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以LO2細(xì)胞為研究對(duì)象。

圖1 TOTM對(duì)肝細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 TOTM對(duì)LO2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

倒置顯微鏡下，對(duì)照組細(xì)胞分界清楚、表面光滑, 細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常。0.25 mg/mL TOTM組，開始有少部分細(xì)胞失去正常的形態(tài)，出現(xiàn)細(xì)胞變圓現(xiàn)象; 0.5 mg/mL TOTM組部分細(xì)胞變圓，出現(xiàn)形態(tài)模糊、分界不清; 1.0 mg/mL TOTM組明顯可見大量細(xì)胞變圓，皺縮，表面粗糙。提示高劑量TOTM可明顯導(dǎo)致肝細(xì)胞形態(tài)改變。

2.3 TOTM對(duì)LO2細(xì)胞凋亡的影響

由流式細(xì)胞分析結(jié)果可知，0.25～1.0 mg/mL 的TOTM可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率分別為7.4% ± 1.0%，11.6%±1.5%和18.5%±1.9%，明顯高于對(duì)照組(2.4%±0.3%)(P<0.05)。并隨著TOTM濃度的增加，細(xì)胞凋亡率越高。

2.4 TOTM對(duì)LO2細(xì)胞培養(yǎng)液AST、ALT和LDH含量的影響

由表1可知, TOTM與LO2肝細(xì)胞作用48 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性明顯升高; TOTM 0.062 5～1.0 mg/mL劑量組AST活性顯著升高(P<0.05)，而TOTM 0.125～1.0 mg/mL劑量組ALT活性顯著升高(P<0.05)，具有一定的量效關(guān)系。另一方面，TOTM 0.062 5～1.0 mg/mL劑量作用LO2肝細(xì)胞作用48 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH水平顯著增加, 與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05),提示TOTM可造成肝細(xì)胞膜損傷，膜通透性增加，進(jìn)而增加LDH釋放。

圖2 TOTM對(duì)LO2細(xì)胞形態(tài)的影響

表1 TOTM對(duì)LO2細(xì)胞培養(yǎng)液AST、ALT和LDH含量的影響

3 討論

醫(yī)用塑料用于制造人工臟器或輸血袋、輸液袋等醫(yī)療器械，由于要與人體、血液或藥液接觸，要求塑料材料中的組分不能析出進(jìn)入藥液或人體，不會(huì)引起組織器官的毒性和損傷。目前，有約1/3的醫(yī)療器械由聚氯乙烯(PVC)材料制成。PVC類材料在醫(yī)療器械中應(yīng)用廣泛，最主要原因是其具有柔軟性和易彎曲性等良好的物理性質(zhì)。此外，這類材料與靜脈注射液和血液之間具有良好的相容性[6]。常見的PVC類產(chǎn)品中都含有增塑劑如鄰苯二甲酸酯(DEHP)、TOTM等，用以改進(jìn)材料的柔軟性、延伸性和加工性。這種增塑劑與 PVC的結(jié)合是一種物理過程，會(huì)隨著時(shí)間的增長而緩慢逸出，進(jìn)入到與之接觸的介質(zhì)中; 同時(shí)，部分藥物或藥用輔料的助溶作用促進(jìn)了增塑劑從材料中的釋放，增加了患者暴露于增塑劑中的可能性[7]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)[2]報(bào)道，醫(yī)療器械塑料制品中DEHP的24～72 h溶出率為1.27%～1.34%，對(duì)苯二甲酸二辛酯(DEPT) 為0.11%～0.46%，而TOTM為0.07%～0.17%; 相較于其它種類的增塑劑，TOTM溶出率具有更明顯的時(shí)間依賴性。我國《食品容器、包裝材料用添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》嚴(yán)格規(guī)定了DEHP從食品包裝材料遷移到食品的遷移量為1.5 mg/kg，與世界發(fā)達(dá)國家的規(guī)定一致。因此，人們對(duì)增塑劑的生物安全性評(píng)估頗為關(guān)注[8-10]?，F(xiàn)已明確DEHP的成人每日攝入限定量為25 mg/kg[2]，但目前有關(guān)TOTM的毒性研究及成人每日攝入限定量尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了TOTM對(duì)多種肝細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果顯示TOTM對(duì)HepG2、LO2、Hep1-6肝細(xì)胞的IC50分別為1.74 mg/mL、0.34 mg/mL和0.23 mg/mL。隨著TOTM濃度劑量的增加, 0.125～1.0 mg/mL劑量的TOTM能升高人正常肝細(xì)胞上清中AST、ALT含量, 促進(jìn)LDH釋放,并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。項(xiàng)目組前期研究表明，TOTM可引起小鼠肝組織細(xì)胞壞死和脂滴堆積，這一結(jié)果亦佐證了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。證明了TOTM具有潛在的肝毒性，但其具體的毒性機(jī)制急需進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn):

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[中圖分類號(hào)]Q95-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1674-5817(2016)02-0212-04

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.011

[收稿日期]2015-12-28

[基金項(xiàng)目]浙江省食品藥品監(jiān)管系統(tǒng)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014001),浙江省衛(wèi)生高層次人才項(xiàng)目(014)

[作者簡介]陳獻(xiàn)花。E-mail: 919940015@qq.com

[通訊作者]應(yīng)華忠。E-mail: YHZ0101@126.com