邢寶才 劉偉

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體液檢測在結(jié)直腸癌中應(yīng)用的研究進展

邢寶才 劉偉

邢寶才 教授、主任醫(yī)師、博士生導(dǎo)師。北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院肝膽外一科主任，外科教研室主任。從事腫瘤外科的臨床與研究近三十年，主要的研究領(lǐng)域是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，原發(fā)性肝癌的外科治療。對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的外科手術(shù)與圍手術(shù)期的治療有較高的造詣。目前擔(dān)任著中華外科學(xué)會肝臟外科學(xué)組委員、中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會常委、中國抗癌協(xié)會大腸癌委員會肝轉(zhuǎn)移學(xué)組委員、中國醫(yī)師協(xié)會外科分會MDT專委會副主任委員、中國醫(yī)師協(xié)會外科分會肝臟外科委員會常委、中國醫(yī)促會肝臟外科分會副主任委員、中國醫(yī)促會結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移分會常委。擔(dān)任《中華肝膽外科雜志》等多個雜志的編委。

【摘要】體液檢測是指以血液為主的體液標(biāo)本中細胞及核酸的檢測，包括了循環(huán)腫瘤細胞和循環(huán)腫瘤DNA 兩大類。能幫助實時動態(tài)監(jiān)測腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)灶基因組信息，協(xié)助早期診斷、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷，也有助于靶向治療適應(yīng)癥的評估，從而推進精準(zhǔn)醫(yī)療的實施。液態(tài)活檢屬于新型的無創(chuàng)性分子病理檢測方式。在結(jié)直腸癌診療領(lǐng)域具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，也是推動腫瘤基礎(chǔ)研究進展的重要助力。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸腫瘤； 治療應(yīng)用； 體液檢測； 循環(huán)腫瘤細胞，循環(huán)腫瘤DNA

作者單位：100142 北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所肝膽胰外一科， 惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室

結(jié)直腸癌在我國發(fā)病率居所有惡性腫瘤中第五位。2015年我國新發(fā)病例376300，死亡率191，000［1］。其中，50%結(jié)直腸癌患者會發(fā)生肝轉(zhuǎn)移［2-3］。通過多學(xué)科治療，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移5年生存率和10年生存率可達到50%和20%［4-5］。然而，目前現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物在預(yù)測復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面并不盡如人意，其存在滯后性且靈敏度和特異度都較低。因此，結(jié)直腸癌研究的一個重要目標(biāo)就是找到可以方便準(zhǔn)確預(yù)測復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記物。隨著對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的深入研究，對于手術(shù)后切除預(yù)后預(yù)測，療效評估及復(fù)發(fā)監(jiān)測，體液檢測在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中逐漸進入更為廣泛的研究。其主要指血液中包含的兩種可以用于分析腫瘤分子表型的物質(zhì)，即循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）和循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor，ctDNA）。

循環(huán)腫瘤細胞是指能在腫瘤患者外周血中檢測到、來源于實體腫瘤、逃離宿主免疫殺傷后存活的異質(zhì)性腫瘤細胞［6］。進入血液循環(huán)而未被清除的腫瘤細胞通過遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶［7］。CTC以單個細胞或細胞團（又稱循環(huán)腫瘤微栓子，CTM）存在于循環(huán)系統(tǒng)中。研究發(fā)現(xiàn)CTC的形成與上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）機制有關(guān)［8］。血液中的CTC 既可能是直接從病灶脫落進入血液中的上皮特征CTC，也可能是經(jīng)歷EMT由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入并生存于血液循環(huán)中的CTC。最新研究發(fā)現(xiàn)，CTM與間質(zhì)細胞表型CTC密切相關(guān)，并且高比例的間質(zhì)細胞表型CTC與化學(xué)治療耐藥有關(guān)［9］。

循環(huán)腫瘤DNA是一類源于腫瘤細胞的雙鏈DNA片段，大小在0.18～21 kb之間，主要存在于血液、滑膜液和腦脊液等液體中，可經(jīng)尿液和糞便排出，含量極微。ctDNA的發(fā)現(xiàn)可追溯至對循環(huán)游離DNA（cell-free circulatingDNA，cfDNA）的早期研究中。cfDNA是由機體細胞釋放入外周血循環(huán)后發(fā)生部分降解的內(nèi)源性DNA。1977年Leon等發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血中cfDNA濃度較正常人顯著升高，且具有腫瘤細胞的基因組特征［10-11］。通過對cfDNA中腫瘤特異性的畸變（如腫瘤原癌基因和致癌基因突變、微衛(wèi)星改變和DNA甲基化等）的識別，證實其為腫瘤細胞來源的cfDNA，即ctDNA，且與腫瘤細胞基因組信息相一致［11］。ctDNA主要來源于：1.壞死的腫瘤細胞；2.凋亡的腫瘤細胞；3.腫瘤細胞的外排體。

一、常用檢測技術(shù)

（一）CTCs分離、富集相關(guān)技術(shù)

1.免疫磁珠富集法（immunomagnetic beadsseparation，IMS）

IMS技術(shù)基于細胞表面的抗原與連有特異性抗體的磁珠相結(jié)合，并在外源磁場的作用下富集細胞，其根據(jù)分離的策略可以分為陽性富集法和陰性富集法兩大類。陽性富集法是指磁珠結(jié)合得到的細胞就是所需要的細胞。目前唯一已獲得美國食品藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)上市的循環(huán)腫瘤細胞檢測試劑盒就是針對細胞表面的上皮細胞粘附分子來分離CTCs。根據(jù)CTCs的含量與臨床預(yù)后的關(guān)聯(lián)其他還在研究階段的磁珠包被標(biāo)記物如廣譜標(biāo)記物（全角蛋白）和其他腫瘤類型相關(guān)標(biāo)記物如CerBb2、Mucin、AFP等。此外，用于分離CTCs的標(biāo)記物除了蛋白質(zhì)類標(biāo)記物，還包括了mRNA 和端粒酶類的標(biāo)記物，提高了CTCs的檢出效率［12］。陰性富集法是指磁珠結(jié)合得到的細胞不是所需要的細胞，主要應(yīng)用了針對白細胞的廣譜標(biāo)記物CD45，在磁場作用中剔除了有核細胞游中的白細胞，其中未被結(jié)合的細胞就是所需要的CTCs，能大大增加CTCs 的檢出數(shù)量［13］。

2.CTCs芯片技術(shù)

第一代CTCs芯片是基于微流體學(xué)原理，以微陣距的方式將針對CTCs細胞表面標(biāo)記物（EpCAM）的抗體包被在芯片上，當(dāng)血液樣本通過芯片時，就能通過抗體將其中的CTCs細胞捕獲下來。第二代芯片根據(jù)微流體渦流原理設(shè)計了彎道型的內(nèi)槽，增加了細胞與包被抗體時間的接觸時間，顯著提高了CTCs的獲取效率［14］?？梢栽谛酒线€能進行各種原位檢測，如蘇木素-伊紅染色、免疫熒光染色等，透過芯片通過顯微鏡能直觀地觀察CTCs的形態(tài)學(xué)特征和染色結(jié)果。

3.濾過膜分離法（filter membrane filtration，F(xiàn)MF）

FMF技術(shù)基于CTCs 的細胞體積顯著大于白細胞的原理，采用一定孔徑的濾過膜將CTCs從血液中分離出來，也被稱為膜濾過分離腫瘤細胞技術(shù)（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET），每毫升血液中可以提取到至少1個腫瘤細胞［15］。由于ISET法分離CTCs主要基于細胞的體積而不是細胞表面的相關(guān)抗原，因此主要適用于異質(zhì)性明顯的惡性腫瘤如肺癌、胃癌和前列腺癌等，大大降低了由于抗原交叉表達或差異表達而導(dǎo)致的假陽性率［16］。

（二）ctDNA分離及檢測技術(shù)

ctDNA由于片段較小、含量很少，而且容易和血漿蛋白相結(jié)合，因而常規(guī)的提取效率都不高。針對血漿中ctDNA的抽提原理主要有四大類：鹽析法、酚-氯仿抽提法、微柱吸附法和磁珠吸附法。而傳統(tǒng)的鹽析法和酚-氯仿法由于操作步驟復(fù)雜、需要使用有機溶劑、ctDNA的提取效率較低。通過比較各類試劑盒發(fā)現(xiàn)，磁珠法獲得的ctDNA在質(zhì)量和含量上都要優(yōu)于微柱吸附法，假陽性率也較低。ctDNA檢測技術(shù)根據(jù)檢測目的來選擇相應(yīng)的技術(shù)方法，其中大部分是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，如實時熒光定量PCR、甲基化特異性PCR等，也有基于微珠富集原理的方法［17］。目前，ctDNA檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于K-ras、BRAF、HER-2、p53、EGFR、APC等腫瘤靶向治療、診斷及預(yù)后相關(guān)標(biāo)記的檢測。

二、臨床應(yīng)用

（一）判斷預(yù)后

CTC可以預(yù)測患者預(yù)后。一項薈萃研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CTC＞3個/7.5 mL，則結(jié)直腸癌的5年生存率較低，治療效果也較差；但如果治療后CTC水平可下降（＜3個/7.5 mL），則預(yù)后較好［18］。該研究表明，CTC數(shù)量的多少與結(jié)直腸癌患者遠處轉(zhuǎn)移以及預(yù)后關(guān)系密切，可用于判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后。同時，Cohen等人發(fā)現(xiàn)，CTC≥2個是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的不良預(yù)后因素（HR：2.78，95%CI：1.10～7.02），并且與圍手術(shù)期死亡率相關(guān)。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者CTC平均數(shù)目普遍多于無轉(zhuǎn)移的患者，而且可切除的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者CTC陽性率遠低于不可切除患者［19］。

（二）療效評估

隨著腫瘤藥物多樣化的出現(xiàn)，如何選擇安全可靠的療效評估手段以驗證新的治療方法的有效性，是腫瘤治療過程中所面臨的重要挑戰(zhàn)。目前臨床常用的療效監(jiān)測方法，包括血清學(xué)指標(biāo)和影像學(xué)檢查均存在諸多不足。體液檢測能否成為療效評估的手段，已經(jīng)引起越來越多的注意。ctDNA作為一種新的生物標(biāo)志物，可滿足臨床實時、動態(tài)、無創(chuàng)監(jiān)測腫瘤負(fù)荷變化的要求。Tie等人發(fā)現(xiàn)，術(shù)前化療的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者，ctDNA水平可以在化療2周期后發(fā)生顯著下降；而相應(yīng)的CT檢查則需要化療開始后的8～10周時才能進行評價。同時，ctDNA水平降低10倍以上時，肝切除術(shù)后無病生存時間明顯延長。CTC計數(shù)不僅在晚期腫瘤患者的預(yù)后評估方面具有意義，其治療前后的數(shù)目變化，也可在一定程度上反映療效，可能在療效監(jiān)測方面具有意義。Nole等研究顯示，治療前CTC超出5個/7.5 mL的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，約一半患者的CTC數(shù)目可在治療中降低［20］。若CTC數(shù)目無變化或增高，則提示治療無效。

（三）復(fù)發(fā)監(jiān)測

目前，術(shù)后或放療后，體液檢測能否根據(jù)分子水平證據(jù)判斷復(fù)發(fā)仍舊存在爭議?；颊咄庵苎幸呀?jīng)有腫瘤細胞的存在。雖然，大部分腫瘤細胞被免疫系統(tǒng)吞噬，但是在適當(dāng)?shù)臈l件下能進一步發(fā)展成新的腫瘤灶。早期研究通過RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)未接受相關(guān)治療的患者已知的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生活化，是復(fù)發(fā)的前期表現(xiàn)［21］。觀察結(jié)直腸癌患者術(shù)后2～5年ctDNA的情況，結(jié)果顯示術(shù)后檢測到ctDNA的患者病情復(fù)發(fā)，而陰性的患者沒有復(fù)發(fā)［22］。因此ctDNA是切除后殘留病灶的潛在標(biāo)志物。ctDNA應(yīng)在手術(shù)后（在一般情況下，手術(shù)后6～8周）輔助治療之前進行檢測，以得到最佳的治療決策。不過，某些情況下cfDNA濃度低于檢出突變的最佳量，所以使用ctDNA 作為診斷癌癥和檢測微小殘留病灶時需要高度特異性的標(biāo)記物及更靈敏的分析技術(shù)。

（四）靶向藥物治療的耐藥性監(jiān)測

CTCs對晚期腫瘤患者進行預(yù)后判斷以及療效監(jiān)測的意義，都是基于其數(shù)目的變化。而CTCs的另一項潛在臨床價值是基于其分子改變確定靶向藥物的耐藥性監(jiān)測。有文獻報道，可在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的CTCs中檢測到KRAS基因的突變［23］，并且30%接受靶向藥物治療的患者會發(fā)生繼發(fā)性KRAS基因突變。提示通過跟蹤檢測外周血中CTCs的分子改變，可以作為靶向藥停用的依據(jù)。尤其是針對不易獲得腫瘤組織的晚期轉(zhuǎn)移性腫瘤患者，在使用靶向藥物治療前，通過檢測腫瘤組織和（或）CTCs的分子改變來選擇靶向藥物；在靶向藥物治療過程中，通過動態(tài)監(jiān)測CTCs的分子改變，來判斷靶向藥物治療的終點。分子改變早于影像學(xué)改變，從而提示臨床醫(yī)生對治療過程的早期干預(yù)、降低不必要的費用、減輕患者遭受的不良反應(yīng)。

（五）腫瘤負(fù)荷

結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者常規(guī)評價腫瘤負(fù)荷的方法僅局限于影像學(xué)檢查。對于術(shù)前化療患者的有效性評價，也僅僅依靠RECIST標(biāo)準(zhǔn)。體液檢測的出現(xiàn)，能夠確切評價肝臟腫瘤負(fù)荷。Kaifi通過回顧性分析24例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CTC≥3個/ 7.5 mL時，腫瘤/肝體積比＞30%；并且CTC數(shù)目與血中CEA水平保持高度一致性［24］。

綜上，相較于傳統(tǒng)的組織活檢或固相活檢，體液檢測的優(yōu)勢十分明顯。由于樣本來源是體液，尤其是血液，臨床獲得樣本途徑非常簡便，可以做到隨時取樣、隨時監(jiān)測，但是液態(tài)活檢有一定的局限性。

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（本文編輯：楊明）

邢寶才,劉偉. 體液檢測在結(jié)直腸癌中應(yīng)用的研究進展[J/CD].中華結(jié)直腸疾病電子雜志, 2016, 5(2): 110-113.

?述評?

The advances of the liquid biopsy in colorectal cancer

Xing Baocai, Liu Wei. Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research, Ministry of Education, Peking University School of Oncology, Beijing Cancer Hospital and Institute, Beijing 100142, China Corresponding author: Xing Baocai, Email: xingbaocai88@sina.com

【Abstract】Liquid biopsy refers to the analyses of circulating tumor cells or circulating tumor DNA that mainly exist in the bloodstream and other body fluid. Liquid biopsy is a novel kind of non-invasive technique and has a wide prospect of clinical application in the molecular pathological field. This review presents the advances of liquid biopsy and its clinical application values in the field of colorectal cancer, including prognosis assessment, early cancer screening and prediction of treatment responses.

【Key words】Colorectal neoplasms; Therapeutic uses; Liquid biopsy; CTC; ctDNA

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.02.01

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81371868）

通信作者：邢寶才，Email：xingbaocai88@sina.com

收稿日期：（2016-3-26）