孔勤 張并璇 張浩軍 嚴(yán)美花 李平

[摘要]肥胖、脂代謝紊亂及其相關(guān)代謝疾病，包括非酒精性脂肪肝（NAFLD）是公認(rèn)的重要危險因素，患病人數(shù)逐年增加，已成為嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病之一。該研究主要探究糖腎方對C57BLKS/J db/db（db/db）小鼠脂代謝紊亂與巨噬細(xì)胞活化分型的作用及機(jī)制。8周齡雄性自發(fā)性糖尿病肥胖db/db小鼠與同源不發(fā)病db/m小鼠，隨機(jī)分為正常對照組（db/m）、模型組（db/db）、糖腎方給藥組（db/db+TSF），連續(xù)喂養(yǎng)12周后處死動物，留取組織標(biāo)本備用。油紅O染色檢測肝臟脂滴沉積，免疫組織化學(xué)法檢測肝臟巨噬細(xì)胞活化分型標(biāo)記物 CD68，F(xiàn)4/80的表達(dá)變化；熒光定量PCR法檢測白色脂肪組織巨噬細(xì)胞活化標(biāo)記物Mrc1，Arg1，TNFα等mRNA表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織脂質(zhì)沉積增多，TSF干預(yù)后脂質(zhì)沉積顯著減少； db/db小鼠肝臟組織CD68和F4/80的表達(dá)增加，TSF干預(yù)后可顯著抑制其表達(dá)水平；此外，與正常對照組相比，db/db小鼠白色脂肪組織巨噬細(xì)胞活化標(biāo)記物Mrc1，Arg1和TNFα mRNA表達(dá)增加，TSF干預(yù)后TNFα顯著下降，但Mrc1，Arg1無顯著差異。結(jié)果表明中藥糖腎方可減輕db/db小鼠肝臟脂肪變，改善血脂異常，其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]糖腎方；非酒精性脂肪肝；肝臟脂肪變；巨噬細(xì)胞活化

[Abstract]Obesity and its associated metabolic disorders， including nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）， have become major chronic diseases threatening public health NAFLD is a chronic liver disorder that is strongly associated with type 2 diabetes and obesity In this study， we investigated the effects and mechanism of Tangshen formula （TSF） on hepatic dyslipidemia and phenotypic switch of macrophage in db/db mice Eightweekold male C57BLKS/J db/m control and db/db mice were divided into 3 groups （namely db/m， db/db， db/db+TSF）， and fed with TSF or distilled water for 12 weeks It was found that after treatment with TSF， the triglycerides accumulation in db/db mice was decreased on the basis of oil red O staining with cryosections of liver tissues And protein expressions of macrophage activation markers CD68 and F4/80 were decreased according to immunohistochemical analysis of hepatic sections The mRNA level of TNFα （M1 marker） was significantly decreased by TSF in db/db mice， but with no significant difference in Mrc1 and Arg1 （M2 marker） According to the results， TSF attenuated hepatic steatosis and relieved dyslipidemia， its mechanism may be correlated with the regulation of macrophage activation and phenotypic switch

[Key words]Tangshen formula； nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）； hepatic steatosis； macrophage activation

doi：10.4268/cjcmm20160920

非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease， NAFLD）是一類以甘油三酯為主的脂質(zhì)在肝臟組織中異常蓄積為病理改變的疾?。ǔ嬀坪推渌衙鞔_的肝損傷因素），是最為常見的一類慢性肝臟疾病，目前我國患病率約為15%～30%[1]。其發(fā)生發(fā)展包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝硬化和肝癌4個階段。有研究顯示亞洲人群中糖尿病、肥胖及血脂異常患者中NAFLD的患病率顯著增加，約為35%～80%[1]。盡管目前對NAFLD的認(rèn)識越來越深入，但NAFLD病因和發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明了。近年研究表明NAFLD的發(fā)生發(fā)展與肥胖、胰島素抵抗、炎癥及巨噬細(xì)胞活化有著密切的聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞的活化分型在肥胖誘導(dǎo)的組織炎癥和胰島素抵抗中發(fā)揮著重要作用，其對于NAFLD的發(fā)生發(fā)展有著顯著的調(diào)節(jié)作用，其激活方式以經(jīng)典（activated， M1）與選擇性（alternatively activated， M2）激活方式參與此過程的發(fā)生發(fā)展[2]。糖腎方是李平教授繼承名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上總結(jié)的科研用方，以往研究表明中藥復(fù)方糖腎方顆?？娠@著減輕糖尿病腎病大鼠肝腎損傷并降低血漿甘油三酯和總膽固醇水平[3]。本研究通過利用NAFLD模型db/db小鼠研究糖腎方對其脂質(zhì)代謝的影響并探討巨噬細(xì)胞不同分型在NAFLD中的作用，為糖腎方下一步臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

11試劑與儀器TRIzol試劑（Invitrogen，美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ThermoFisher，美國）；UltraSYBR Mixture（康為世紀(jì)公司，中國）；油紅O染液（Sigma，美國）；CD68抗體[Abcam（1∶400），美國]；F4/80抗體[Abcam（1∶200），美國]；光學(xué)顯微鏡（Olympus BX43型光學(xué)顯微鏡，日本）；ABI 7500熒光定量PCR儀（ABI，美國）。

12動物自發(fā)性2型糖尿病及肥胖C57BLKS/J db/db 小鼠（以下簡稱db/db小鼠），雄性，8周齡，體重（35±5） g；同遺傳背景C57BLKS/J db/+正常小鼠（以下簡稱db/m小鼠），體重（20±2） g，以上動物購自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）20110001。所有小鼠飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院SPF級實(shí)驗(yàn)動物室屏障環(huán)境，使用許可證號SYXK（京）20100011。溫度（23±3） ℃，相對濕度（55±15）%，光照12 h明暗交替，自由飲水和進(jìn)食，普通飼料飼喂。本次實(shí)驗(yàn)所有操作均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

13受試藥物糖腎方配方顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司制劑），批號1206346，規(guī)格8 g/袋。組成：黃芪、生地、大黃、山茱萸、鬼箭羽、三七、枳殼7味中藥。實(shí)驗(yàn)動物購入順應(yīng)性喂養(yǎng)2周，稱重并進(jìn)行基礎(chǔ)狀態(tài)觀察，隨機(jī)分組情況見表1。實(shí)驗(yàn)動物于第10周開始灌胃給藥，每日1次，每周稱重，連續(xù)給藥12周。糖腎方劑量參考前期臨床研究并按照標(biāo)準(zhǔn)動物劑量換算[4]。

14標(biāo)本采集禁食12 h，眼內(nèi)眥取血，離心收集上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。全自動生化儀檢測血清總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）。實(shí)驗(yàn)動物于第22周處死，收集肝臟和皮下白色脂肪組織，濾紙吸取水分，稱重，切取部分4%多聚甲醛中固定1 h，取出放入30%蔗糖溶液中脫水過夜，OCT包埋，-80 ℃冰凍，常規(guī)冰凍切片5 μm，-80 ℃保存?zhèn)溆?；其余中性甲醛中固定，石蠟包埋，備石蠟切片用?/p>

15油紅O染色病理學(xué)觀察將肝臟冰凍切片從冰箱中取出，室溫下平衡15 min，60%異丙醇稍洗切片，油紅O染液染色15 min，60%異丙醇洗去多余染液，自來水沖洗2 min，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，自來水沖洗泛藍(lán)5 min，甘油封片，顯微鏡下觀察病理改變并使用ImagePro Plus 軟件統(tǒng)計分析。

16免疫組織化學(xué)檢測取新鮮肝臟組織，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片（5 μm）。常規(guī)脫蠟至水，TBST洗滌3次，3% H2O2孵育15 min，熱抗原修復(fù)，TBST洗滌3次，滴加CD68（1∶400）或者F4/80（1∶200）抗體，置4 ℃冰箱過夜；取出，室溫放置30 min，TBST洗滌3次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色劑顯色（1∶150），蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。次日顯微鏡下觀察并使用ImagePro Plus 軟件統(tǒng)計分析結(jié)果。

17實(shí)時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR）將組織從液氮中取出放入15 mL離心管中，加入適量TRIzol后置于冰上，電動均漿機(jī)使組織充分裂解后，加入100 μL氯仿，劇烈振動40 s，靜置2 min使其自然分相；4 ℃，13 000 r·min-1離心15 min，用微量移液器小心吸取最上層液體移入新的EP管中；每個管中加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min使RNA沉淀；4 ℃，13 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，加入75%乙醇（DEPC水配制）1 mL洗去異丙醇并再次4 ℃，13 000 r·min-1離心5 min；放入超凈工作臺中自然晾干，加入30 μL的RNasefree水溶解；測定RNA濃度，按照試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR。引物合成由Invitrogen有限公司完成。引物序列見表2。

孔勤等：糖腎方改善db/db小鼠脂代謝紊亂與巨噬細(xì)胞活化分型的實(shí)驗(yàn)研究表2實(shí)時熒光定量PCR引物序列

Table 2List of primers used for quantitative real timePCR

基因正向引物（5′3′）反向引物（5′3′）PCR大小/bpUcp2ATGGTTGGTTTCAAGGCCACACGGTATCCAGAGGGAAAGTGAT109TNFαCAGGCGGTGCCTATGTCTCCGATCACCCCGAAGTTCAGTAG89Ccl2TTAAAAACCTGGATCGGAACCAAGCATTAGCTTCAGATTTACGGGT121F4/80CTGCACCTGTAAACGAGGCTTGCAGACTGAGTTAGGACCACAA127CD68TGTCTGATCTTGCTAGGACCGGAGAGTAACGGCCTTTTTGTGA75Mrc1CTCTGTTCAGCTATTGGACGCTGGCACTCCCAAACATAATTTGA190Arg1CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAGAGGAGCTGTCATTAGGGACATC184

18數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理所有計量數(shù)據(jù)均表示為±s，采用GraphPad Prism 60軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢驗(yàn)方法采用Oneway ANOVA分析和Dunnettt檢驗(yàn)，P<005視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

21肝組織形態(tài)學(xué)觀察正常對照組db/m小鼠肝臟形態(tài)正常，色澤紅潤，質(zhì)地柔軟。db/db小鼠肝組織體積異常增大，色澤土黃，質(zhì)地較硬，表面油膩感較顯著，提示該組小鼠肝臟脂肪變嚴(yán)重；給予糖腎方后，色澤質(zhì)地均有顯著改善，觸之無明顯油膩感，體積顯著減小，見圖1。

Adb/m小鼠； Bdb/db小鼠； Cdb/db+TSF小鼠。

22糖腎方對db/db小鼠體重和肝重的影響db/db小鼠較db/m小鼠體重增加顯著；連續(xù)給藥12周后，與db/db組相比較，糖腎方可顯著減少db/db小鼠體重增加和肝臟質(zhì)量，見圖2。

23糖腎方對db/db小鼠血脂及肝臟脂質(zhì)沉積的影響與db/m小鼠相比，db/db小鼠血清中TC和TG 含量顯著上升，表明小鼠體內(nèi)出現(xiàn)脂肪代謝異常，給予糖腎方后可顯著降低db/db小鼠血清TC和TG水平；此外，油紅O染色顯示db/m小鼠肝細(xì)胞幾乎無脂肪滴，肝細(xì)胞排布整齊，而db/db小鼠肝臟組織分布大量脂肪滴和空泡，脂肪變性程度嚴(yán)重，油紅O陽性著色面積顯著增加，給予糖腎方治療的小鼠脂質(zhì)沉積顯著下降，空泡減少，見圖3。

24糖腎方對db/db小鼠肝臟組織巨噬細(xì)胞活化的影響實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常db/m小鼠比較，db/db小鼠肝臟組織巨噬細(xì)胞標(biāo)記物基因CD68和F4/80顯著上調(diào)，給予糖腎方后表達(dá)均有顯著下降；免疫組織化學(xué)結(jié)果同樣證實(shí)糖腎方可顯著降低CD68和F4/80的表達(dá)，見圖4。

25糖腎方對db/db小鼠白色脂肪組織巨噬細(xì)胞

與db/m 小鼠相比**P<0001；與db/db小鼠相比#P<001， ##P<0001。

極化分型的影響與肝臟組織中巨噬細(xì)胞活化情況相同，db/db小鼠白色脂肪組織（white adiposetissue，WAT）CD68和F4/80基因mRNA水平顯著高于db/m小鼠，而糖腎方可顯著抑制CD68和F4/80 mRNA的水平；此外，與db/m小鼠相比，db/db小鼠白色脂肪組織巨噬細(xì)胞M1活化標(biāo)記物腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α， TNFα）mRNA水平顯著升高，給予糖腎方后可顯著降低其表達(dá)；M2型活化標(biāo)記物甘露糖C型受體1（mannose receptor C type 1， Mrc1）和精氨酸酶（arginase， Arg1）同樣顯著上調(diào)，但糖腎方干預(yù)后并未抑制其mRNA水平；與此同時，趨化因子（chemokine ligand 2， Ccl2）和解耦聯(lián)蛋白2（uncoupling protein 2， Ucp2）mRNA水平也較db/m小鼠顯著上調(diào)，糖腎方干預(yù)后顯著抑制其表達(dá)，見圖5。

3討論

C57BLKS/J db/db小鼠是Leptin受體基因缺陷導(dǎo)致的自發(fā)型2型肥胖與糖尿病小鼠，其具有血脂、血糖異常，體重增加等表現(xiàn)，亦有肝臟脂肪樣變出現(xiàn)，是良好的脂肪肝動物模型之一，故本實(shí)驗(yàn)利用db/db小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象來研究糖腎方在調(diào)節(jié)脂代謝紊亂中的作用及相關(guān)機(jī)制。

NAFLD發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，由Day和James在1998年提出的“二次打擊”學(xué)說是目前較為公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制[5]。首先由于肥胖、糖尿病等導(dǎo)致胰島素抵抗引起脂代謝異常，游離脂肪酸與甘油三酯升高，

異位沉積在肝臟等組織造成肝脂肪變；第二次打擊由于機(jī)體內(nèi)氧化平衡失調(diào)導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，隨之出現(xiàn)脂毒性與炎癥因子釋放致使肝細(xì)胞受損。

近年來越來越多的學(xué)者關(guān)注到肝臟巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)也許是NAFLD發(fā)病機(jī)制的基石而起到了重要的調(diào)節(jié)作用[68]。巨噬細(xì)胞為一群異質(zhì)性較大的細(xì)胞，其來源于骨髓細(xì)胞并分化為成熟的單核細(xì)胞進(jìn)入外周血，然后進(jìn)入各組織后分化為巨噬細(xì)胞，如肝臟中的Kuffer細(xì)胞，在不同的生理病理和刺激情況下巨噬細(xì)胞會有不同的激活途徑，發(fā)揮各自的生物學(xué)功能。肝臟是人體重要的免疫器官，脂肪組織產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子如趨化因子、腫瘤壞死因子都會對肝臟組織的內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生影響，如誘導(dǎo)組織產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生發(fā)展。此外，脂質(zhì)異常沉積在肝臟組織也會刺激Kuffer細(xì)胞激活從而引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)，這一系列的結(jié)果將會激活肝星狀細(xì)胞進(jìn)而引發(fā)纖維化的發(fā)生[9]。

大量研究表明，巨噬細(xì)胞對脂肪肝炎癥反應(yīng)有著雙重作用，即抑炎和抗炎作用，產(chǎn)生這樣的結(jié)果是由其活化類型決定的[10]。白色脂肪組織分泌的TNFα，IL6等細(xì)胞因子及巨噬細(xì)胞的活化可導(dǎo)致明顯的胰島素抵抗與肥胖病人的肝臟損傷[1112]。本研究結(jié)果顯示，糖腎方連續(xù)給藥12周后可顯著降低血清甘油三酯、總膽固醇水平并減輕肝臟脂肪變程度；此外，糖腎方顯著抑制肝臟組織和白色脂肪組織中CD68與F4/80的表達(dá)，提示糖腎方對脂肪肝小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞的激活有一定的抑制作用；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)糖腎方可抑制白色脂肪組織M1活化標(biāo)記物TNFα mRNA的表達(dá)，而M2型活化標(biāo)記物Mrc1和Arg1則無顯著降低，推測這可能是脂肪組織內(nèi)環(huán)境改變的一種保護(hù)性機(jī)制。近期有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在NAFLD的炎癥始發(fā)階段和后期大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的浸潤有著密切的聯(lián)系，本研究與此項(xiàng)研究都表明了巨噬細(xì)胞的活化在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程起著重要的作用[1314]。但巨噬細(xì)胞的分型究竟由何種分子與機(jī)制決定，目前并不十分清楚。值得注意的是，與db/m小鼠相比，db/db小鼠白色脂肪組織中Ucp2和Ccl2表達(dá)升高，糖腎方同樣可以抑制其表達(dá)水平，表明糖腎方改善脂代謝紊亂可能與其調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化和抑制炎性細(xì)胞浸潤有關(guān)。有研究表明，炎癥損傷是導(dǎo)致NAFLD發(fā)生進(jìn)展的獨(dú)立危險因素，并可以通過肝臟脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36進(jìn)而使循環(huán)系統(tǒng)中大量脂肪酸進(jìn)入肝臟合成過多的脂質(zhì)從而促進(jìn)NAFLD的發(fā)生發(fā)展[15]。由此可見，炎癥環(huán)境尤其是肝臟和白色脂肪組織中大量巨噬細(xì)胞的浸潤參與了NAFLD的進(jìn)展。綜上，糖腎方可以顯著改善db/db小鼠脂代謝異常及肝脂肪變，其機(jī)制可能與抑制巨噬細(xì)胞M1型活化，改善肝臟和脂肪組織內(nèi)環(huán)境炎癥狀態(tài)有關(guān)。

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