岑建斌 區(qū)碩俊 李秀英

摘 要：建立了乙醇-乙醚浸提法提取丹參藥材中丹參酮ⅡA的工藝，并采用液-液分配法對(duì)提取液進(jìn)行純化，高效液相色譜測定丹參酮ⅡA的含量。通過單因素實(shí)驗(yàn)研究了不同因素對(duì)丹參酮ⅡA提取率的影響，并進(jìn)行正交試驗(yàn)。優(yōu)化后得出最佳工藝條件為： 料液比1：25，乙醚比例20%，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間50 min。在此工藝條件下進(jìn)行試驗(yàn)，丹參酮ⅡA的提取率為0.187%。優(yōu)化后的方法成本低，毒性低，重復(fù)性好，操作簡便，適合應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān) 鍵 詞：丹參酮ⅡA；乙醇-乙醚；純化；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：TQ 283 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1671-0460（2016）08-1753-03

Abstract： An ethanol-ether extraction process was developed to extract tanshinone ⅡA from Salvia miltiorrhiza，and the extract was purified with liquid-liquid partition method， finally it was detected by HPLC. The effect of different factors on the extraction rate was studied by the single factor experiment， and the orthogonal experiment was designed to optimize the process parameters. The optimum process parameters were obtained as follows： solid-liquid ratio 1：25， the ether dosage 20 %， extraction temperature 50 ℃， extraction time 50 min； under above conditions， the extraction rate can be 0.187 %. The optimized process has low cost， low toxicity and good repeatability， so it can be used in industrial production.

Key words： tanshinone ⅡA； ethanol - ether； purification； orthogonal experiment

丹參酮亦稱總丹參酮，是從中藥丹參（唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza bunge根）中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，其主要化學(xué)成分為丹參酮ⅡA，對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖有抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。研究表明，丹參酮ⅡA在抗感染，降血脂，心肌修復(fù)等方面體現(xiàn)出優(yōu)異的效果[1，2]，長期服用未見有明顯副作用。經(jīng)臨床試用證明丹參酮ⅡA對(duì)心絞痛治療效果顯著，副作用小，對(duì)治療冠心病的新藥開發(fā)具有重大意義[3，4]。

目前，丹參酮ⅡA的提取工藝主要為超聲提取法、加熱回流法、水煎煮法和CO2超臨界流體萃取法等。其中加熱回流法耗時(shí)長，提取裝置復(fù)雜，而水煎煮法需提取的次數(shù)較多，CO2超臨界流體萃取法則成本較高，因此難以應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中[1，5-7]。而超聲提取法操作簡單，提取因素容易優(yōu)化，成本較低，相比于其他方法能更廣泛地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。由于丹參酮ⅡA可溶于甲醇、乙醇、氯仿和乙醚等有機(jī)溶劑中，因此本研究對(duì)比各溶劑對(duì)丹參酮ⅡA的提取率后，采用乙醇-乙醚混合溶液對(duì)丹參酮ⅡA進(jìn)行提取，然后通過正交實(shí)驗(yàn)得出最佳工藝[8-11]。相比現(xiàn)時(shí)的丹參酮ⅡA提取方法，全有機(jī)溶劑提取簡化了晶體析出工藝，提高了丹參酮ⅡA的含量，簡化了操作和節(jié)約了人工和原料成本，適合應(yīng)用于大批量的生產(chǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

丹參（購于廣州市）；無水乙醇，乙醚，無水碳酸鈉（分析純，廣州試劑廠），甲醇（色譜純，美國Fisher公司），一級(jí)實(shí)驗(yàn)用水，丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%，Aladdin Industrial Corporation）；25 mL具塞比色管，TD-6M臺(tái)式低速離心機(jī)，DZF-1B（6050）真空干燥箱，hh4數(shù)顯恒溫水浴鍋，IKA 81M/A 10分析研磨機(jī)；IKA MS3 基本型圓周振蕩器；SCQ-Y300A超聲波恒溫水浴鍋；Agilent 1260液相（四元低壓+二極管陣列檢測器+柱溫箱+自動(dòng)進(jìn)樣器）。

1.2 試驗(yàn)方法

將丹參藥材置于真空干燥箱45 ℃烘干至恒重，粉碎，過三號(hào)篩待用。準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）丹參粉與25 mL比色管中，加入12.5 mL乙醇-乙醚（80：20）提取液后加蓋置于50 ℃恒溫水浴中，超聲50 min后放冷至室溫，用乙醇-乙醚提取液稀釋至刻度線，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min后取上清液5 mL于50 mL燒杯中于70 ℃水浴中蒸至近干。加入5 mL乙醚并轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，往其中加入，10 mL 5 % Na2CO3溶液，于振蕩器振搖30 s，靜置分層后移出上層乙醚至50 mL燒杯中于70 ℃水浴中再次蒸至近干，用無水乙醇少量多次沖洗燒杯，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，并稀釋至刻度線，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，待液相分析。

1.3 分析方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini C18 （250 mm×4.6 mm× 5 μm）；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：甲醇：水（85：15）；進(jìn)樣量：10 ?L；分析時(shí)間為20 min；流速：0.8 毫升/分；設(shè)置波長：200～390 nm；提取波長：269 nm。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

于100 mL具塞容量瓶中精確加入0.100 0 g丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品，并加入適量甲醇輔助以超聲溶解，取出后用甲醇稀釋到100 mL標(biāo)線刻度，得到丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液按倍數(shù)稀釋，得到1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。高效液相色譜分析后，以濃度和峰面積繪制丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)曲線。該曲線的線性方程為Y=10 790X + 1 098，相關(guān)系數(shù)r=0. 999 5，表明進(jìn)樣濃度在1.0～100.0 mg/L之間，丹參酮ⅡA的濃度和峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 乙醚比例對(duì)提取率的影響

由于丹參酮ⅡA極性較低，在多種有機(jī)溶劑中有良好的溶解度，因此在提取液中加入少量低極性溶劑以降低提取液極性。同時(shí)，考慮到液-液分配純化步驟和蒸干濃縮操作，選取了極性和沸點(diǎn)都較低的乙醚。提取液的極性隨乙醚比例的升高而降低，提取液極性過低或過高都會(huì)影響丹參酮ⅡA的溶出，結(jié)果表明，乙醚比例為15 %時(shí)，提取液極性與丹參酮最接近，提取率最高（料液比1：20，溫度50 ℃，時(shí)間30 min），見圖1。

2.2 料液比對(duì)提取率的影響

料液比過小，提取液濃度較大，不利于丹參酮ⅡA溶出，而提取液太多則會(huì)造成浪費(fèi)，導(dǎo)致成本升高。當(dāng)料液比大于1：25時(shí)，提取液中丹參酮ⅡA的含量無明顯變化。因此選取最佳料液比為1：25（乙醚比例10 %，溫度50 ℃，時(shí)間30 min）見圖2。

2.3 超聲溫度對(duì)提取率的影響

在超聲過程中升高溫度對(duì)丹參酮ⅡA的提取率有提高，當(dāng)溫度為30～50 ℃時(shí)，相比于室溫有較明顯的提高。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，提取率仍有上升，但并不明顯。在加熱的條件下，其他脂溶性物質(zhì)有可能開始被浸出，導(dǎo)致產(chǎn)物不純。同時(shí)，由于丹參酮ⅡA極性較低，在分析過程中如果流動(dòng)相中水相比例過大會(huì)導(dǎo)致丹參酮ⅡA析出堵塞色譜柱，如果水相比例過小，且樣品雜質(zhì)較多，則會(huì)增大分離難度，并影響結(jié)果分析。因此，選取最佳超聲溫度為50 ℃（料液比1：20，乙醚比例10 %，時(shí)間30 min）。

2.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

如果提取時(shí)間不夠，丹參酮ⅡA提取不充分。在10～30 min之間，丹參酮ⅡA的提取率時(shí)間的變化較明顯，但超過30 min后，丹參酮ⅡA的提取率變化較為緩慢。結(jié)果表明，選取提取時(shí)間為30～50 min之間，丹參酮ⅡA的含量較高且無明顯差別（料液比1：20，乙醚比例10%，溫度50 ℃），見圖3-4。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)單因素的結(jié)果進(jìn)行研究分析，并根據(jù)分析的結(jié)果對(duì)四個(gè)影響提取率的因素的三個(gè)最佳水平進(jìn)行正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（表1-2）。由極差分析結(jié)果可對(duì)K1、K2和K3的關(guān)系進(jìn)行對(duì)比，分析可得出丹參酮ⅡA提取工藝的最佳水平組合為A2B3C1D3。在此水平條件下，丹參酮ⅡA的提取率為0.187 %。由統(tǒng)計(jì)學(xué)的計(jì)算結(jié)果可以看出，對(duì)丹參酮ⅡA的提取率有顯著性影響為料液比、超聲時(shí)間和提取液乙醚比例，而超聲溫度對(duì)提取率的影響不明顯，其中，表3為詳細(xì)的結(jié)果。

3 結(jié) 論

本研究基于單因素水平優(yōu)化結(jié)果，通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化了丹參酮ⅡA的提取工藝條件，即料液比1：25，乙醚20 %，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間50 min，在此水平下丹參酮ⅡA的提取率為0.187 %。采用了液-液分配方法除去提取液中極性較大的雜質(zhì)，提高了產(chǎn)物中丹參酮ⅡA的含量。同時(shí)，由方差分析的結(jié)果可知，乙醚比例、料液比和超聲溫度的改變對(duì)提取率影響非常顯著。優(yōu)化后的提取工藝，操作簡單，使用毒性試劑較少，適用于實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)。

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