王業(yè)勝+李奇威+周林+管潤鋒+曾常青+朱爽

[摘要] 目的 以核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA ITS）序列作為分子條形碼，對一種常用中藥材鉤藤進行分子鑒定和遺傳分析，并闡明其在鉤藤屬內(nèi)種間的分子系統(tǒng)發(fā)育關系。 方法 通過改良十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法對2015年7月采集的鉤藤進行總DNA提取，利用通用引物對rDNA ITS序列進行PCR擴增，經(jīng)克隆、測序后，運用MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 結(jié)果 測序得到該鉤藤的rDNA ITS區(qū)序列長度為718 bp，序列分析結(jié)果顯示其與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的鉤藤（Uncaria rhynchophylla）rDNA ITS區(qū)序列之間相似度達99.8%，并且在系統(tǒng)發(fā)育樹中并排聚類成一支。 結(jié)論 基于ITS區(qū)序列測定分析的分子生物學方法和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的分子遺傳學方法，可以對鉤藤屬藥用植物進行分子鑒定和遺傳分析，為鉤藤屬藥用植物的種間分類地位以及種類鑒定提供準確的分子證據(jù)。

[關鍵詞] 鉤藤；ITS序列；分子鑒定；系統(tǒng)發(fā)育樹

[中圖分類號] S567.239 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）03（a）-0004-04

[Abstract] Objective To clarify the phylogenetic relationship of one species of Uncaria，molecular identification and genetic analysis were carried out by using the rDNA ITS sequence as molecular barcoding. Methods Molecular identification and genetic analysis were carried out with the rDNA ITS sequence as molecular marker.Total DNA was extracted with modified CTAB method and thereby rDNA ITS regions were amplified with universal primer，sequenced and phylogenetic analysed with MEGA 6.0 at July 2015. Results The entire rDNA ITS sequence of Uncaria was 718 bp.Sequence analysis showed that the rDNA ITS sequence was closely related to Uncaria rhynchophylla available in GenBank and the similarity reached 99.8%. Conclusion Based on molecular biology methods of rDNA ITS region analysis，molecular identification is available in accurate classification on traditional Chinese medicinal material plants in Genus Uncaria and provide molecular evidence for taxonomy and identification of different species in Genus Uncaria.

[Key words] Uncaria；ITS sequence；Molecular identification；Phylogenetic tree

鉤藤是茜草科鉤藤屬植物，主要分布于我國廣東、廣西、四川、云南、貴州等地區(qū)。《中國藥典》2015年版規(guī)定的鉤藤為茜草科植物鉤藤[Uncaria rhynchophylla （Miq.）Miq.ex Havil.]、大葉鉤藤[Uncaria macrophylla Wall.]、毛鉤藤[Uncaria hirsuta Havil.]、華鉤藤[Uncaria sinensis （Oliv.） Havil.]或無柄果鉤藤[Uncaria sessilifructus Roxb.]的干燥帶鉤莖枝[1]。

鉤藤為常用中藥，藥用歷史悠久，具有息風定驚、清熱平肝的功效。但是鉤藤藥材在市場上的分類鑒定比較混亂，影響了中藥材用藥的準確性和安全性。因此，有必要運用DNA分子標記技術進一步對鉤藤屬植物不同種間進行鑒定。核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA ITS）序列作為分子條形碼的鑒定能力已經(jīng)在藥用植物很多個科屬基原植物及藥材的鑒定中得到驗證[2-12]。本研究對采自廣州中醫(yī)藥大學藥王山的一種鉤藤屬藥用植物進行分子鑒定和遺傳分析?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源與鑒定

實驗用的鉤藤樣品于2015年7月采集于廣州中醫(yī)藥大學藥王山。常綠木質(zhì)藤本；小枝四棱柱形，褐色，季凈無毛；葉腋有成對或單生的鉤，向下彎曲，先端尖；葉對生，具短柄，葉片卵形，卵狀長圓形或橢圓形。本鉤藤樣品經(jīng)廣東藥學院曾常青教授初步從形態(tài)上鑒定為鉤藤[Uncaria rhynchophylla （Miq.）Miq.ex Havil.]。鉤藤總DNA的提取采用新鮮采集的葉片，或者使用密封袋中已經(jīng)用硅膠快速干燥過的新鮮采集的葉片。

1.2 儀器和試劑

BIO-RAD T100TM Thermal Cycler PCR儀（美國Bio-Rad公司），Thermo Scientific Heraeus Pico17臺式離心機（美國賽默飛世爾科技公司），HHS-2S電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠），TP - 402電子分析天平（美國丹佛儀器北京有限公司），SW-CJ-1F清潔工作臺（蘇州安泰公司），BG-Sub MIDI水平電泳儀（北京永恒生物器材公司），天能-4100數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能公司），SPX智能型生化培養(yǎng)箱（廣州深華公司）。

SYBR Green Ⅰ電泳染料購自北京百泰克生物技術有限公司，DL2000 DNA Marker購自TIANGEN生化科技（北京）有限公司，pMD18-T Vector、Taq酶以及DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司，通用引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 鉤藤植物基因組DNA的提取 鉤藤植物基因組DNA的提取采用改良的CTAB法[13]：稱量約1 g新鮮采集的葉片在液氮的低溫條件下研磨成細粉末。將粉末轉(zhuǎn)移到50 ml的離心管中，加入約5 ml 65℃預熱的CTAB裂解液（4%CTAB，1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-Cl，25 mmol/L EDTA，2%β-巰基乙醇，1%PVP，pH 8.0），65℃水浴2 h（每隔30 min輕搖振蕩1次）。每1毫升混合液分裝到1.5 ml Eppendorf管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用等體積的Tris飽和酚（pH 8.0），酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）和氯仿-異戊醇（24∶1）各抽提1次，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入0.1倍體積3 mol/L NaAc（pH 5.2）溶液，再加入2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀1 h，12 000 r/min離心10 min，移去上清液，用1 ml 70%冷乙醇洗滌2次，干燥后用50 μl無菌1×三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-ethylene diamine tetraacetic acid，TE）緩沖液回溶。取2 μl回溶后的總DNA溶液進行電泳鑒定，記錄凝膠成像結(jié)果。

1.3.2鉤藤植物ITS序列的PCR擴增以及擴增產(chǎn)物的純化 使用擴增ITS序列全長的引物組[14-15]ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAA-GTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）擴增藥王山的鉤藤植物總DNA的ITS序列。配制20 μl 的PCR體系：10×PCR Buffer（2.5 mmol/L，Mg2+ Plus）2 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μl，引物量為8 pmol，Taq（5 U/μl）0.1 μl，加入模板DNA約50 ng，剩下體積以無菌超純水補足。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共循環(huán)30次，最后在72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在凝膠成像系統(tǒng)下檢測并記錄結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物按照大連寶生物公司的DNA凝膠回收試劑盒的具體操作進行割膠回收和純化。

1.3.3 ITS區(qū)片段的連接、轉(zhuǎn)化以及測序 使用DNA凝膠回收試劑盒純化后的PCR擴增產(chǎn)物與pMD18-T-Vecter連接，形成目的片段與載體構(gòu)成的環(huán)形質(zhì)粒并采用熱激法轉(zhuǎn)化到Escherichia coli JM109感受態(tài)細胞，在選擇性培養(yǎng)基上進行氨芐西林的篩選。從平板上選取3個陽性重組單克隆菌落，進行過夜搖菌后各取1 ml菌液由華大公司進行ITS區(qū)序列測定，每個樣品均進行正反雙向測序。

1.3.4 ITS序列比對分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將測序得到的峰圖采用Bioedit軟件查看和校對，去除低質(zhì)量序列后在NCBI上采用Blast進行比對分析，得到國際基因數(shù)據(jù)上與其同源的序列片段以及序列相似性程度。根據(jù)相似性程度初步確定藥王山鉤藤樣品的基源。將得到的序列運用MEGA軟件（Version 6.06）進行分子系統(tǒng)發(fā)育分析。通過最大簡約法（maximum parsimony，MP）進行計算分析，建立藥王山鉤藤植物的最大簡約樹。用自展檢驗法（Boot-strap text）1000次檢驗MP上各分支的置信水平。

2 結(jié)果

2.1 鉤藤總DNA的提取結(jié)果

藥王山的鉤藤樣品總DNA經(jīng)瓊脂糖電泳后掃描拍照并記錄結(jié)果，可見總DNA電泳圖譜呈現(xiàn)一條清晰完整的主條帶，沒有明顯降解（圖1），說明改良的CTAB法可以有效提取藥王山鉤藤樣品的基因組DNA。

2.2 藥王山鉤藤樣品的ITS序列PCR擴增結(jié)果

以提取的藥王山鉤藤樣品的總DNA為模板，從模板原液開始分別稀釋5個梯度濃度進行ITS區(qū)序列的PCR擴增。從PCR的擴增結(jié)果來看，模板DNA在1×102～1×103的稀釋倍數(shù)時，PCR的擴增效果是最理想的。在模板濃度最佳的情況下，藥王山鉤藤樣品的ITS區(qū)序列的PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖譜呈現(xiàn)清晰完整的條帶，而且條帶較亮，沒有非特異擴增條帶，大小在720 bp左右（圖2），說明在最佳的模板濃度條件下能夠有效擴增ITS區(qū)序列，鉤藤基因組DNA中的抑制物對PCR的影響達到最小。

2.3 ITS序列分析

采用Bioedit軟件查看和校對，可知測序得到的核糖體ITS區(qū)序列的長度為718 bp。為了獲得與該序列親緣關系相近的鉤藤屬其他種的序列，把測序得到的ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的ITS序列進行比較分析。應用Bioedit軟件對DNA序列之間進行比較分析發(fā)現(xiàn)，該鉤藤樣品與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的鉤藤（Uncaria rhynchophylla，KF881265）的相似度最高，達到99.8%，故將該鉤藤植物歸類為鉤藤[Uncaria rhynchophylla （Miq.）Miq.ex Havil.]。

2.4 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

采用MEGA軟件將測序得到的ITS序列與其親緣關系相近的鉤藤屬的其他種的ITS序列進行序列比對后用MP計算和分析，并以Nauclea xanthoxylon（AJ346877）為外類群構(gòu)建一棵藥王山鉤藤植物的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），評估各物種之間的親緣性。通過對14個物種ITS序列的簡約性分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)育樹的枝長為107，一致性指數(shù)為0.739 130，保留指數(shù)為0.796 610，所有位點復合指數(shù)和簡約性信息位點分別為0.707 271與0.588 799。

3 討論

有文獻表明，生物堿是鉤藤的主要化學成分[16]，而生物堿主要是以鉤藤堿和異鉤藤堿為主。鉤藤生物堿的主要功效是抗血栓形成、抗驚厥作用、抗血小板聚集以及降血壓等[17]，但是對于鉤藤的藥效成分，鉤藤屬內(nèi)不同種的鉤藤中藥材還是有明顯的差別[18]。再者市場上銷售的鉤藤中藥材種類比較混亂，僅靠形態(tài)學等傳統(tǒng)的分析方法難以鑒別，經(jīng)常出現(xiàn)以次充好的現(xiàn)象，嚴重影響了中藥材用藥的準確性和安全性。因此，有必要利用一種快速的、高靈敏的方法進一步鑒定鉤藤屬植物的種間關系。隨著分子生物學的快速發(fā)展，應用DNA分子標記技術對藥用植物進行鑒定已逐漸成為研究的熱點[19-20]。而ITS序列作為DNA條形碼的分析技術具有技術簡單、結(jié)果準確、重復性好等優(yōu)點，廣泛應用于藥用植物的鑒定。依靠ITS序列標記能夠作為鉤藤中藥材種內(nèi)和種間鑒別的有效分子標志，利用該方法的原理，對鉤藤屬中藥材進行分子鑒定和遺傳分析，有利于正本清源。

ITS序列的分析方法很好地彌補了中藥材鑒定的傳統(tǒng)分析方法（依據(jù)形態(tài)學、組織學和化學成分等）的不足，可以從分子遺傳角度對鉤藤等藥用植物的種間分類地位以及種類鑒定提供分子生物學證據(jù)，從而增加中藥材用藥的準確性和安全性。本研究對采集自廣州中醫(yī)藥大學藥王山的一種鉤藤植物進行基因組DNA提取，ITS區(qū)序列擴增，序列測定與分析，以及采用MP構(gòu)建該鉤藤樣品在其近緣種之間的系統(tǒng)發(fā)育樹，從樹圖可以看出，該鉤藤樣品與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的鉤藤（U.rhynchophylla，KF881265）聚類成為一枝，支持率達到84%；然后又與鉤藤屬其他種的常用鉤藤植物，分別是華鉤藤（U.sinensis，F(xiàn)J980386）、毛鉤藤（U.hirsute，GU937110）、北越鉤藤（U.homomalla，KF881255）、白鉤藤（U.sessilifructus，GU937111）以及攀莖鉤藤（U.scandens，KF881275）聚類成一枝。由此可見，從分子生物學和遺傳學的角度分析，該鉤藤樣品與GenBank數(shù)據(jù)庫中鉤藤（U.rhynchophylla，KF881265）的親緣關系最近，并且與之序列的相似度高達99.8%，而與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有其他種常用鉤藤植物的親緣關系較遠，并不直接與這些種的鉤藤植物聚類成為一枝，所以從分子系統(tǒng)發(fā)育水平上支持了根據(jù)形態(tài)特征把該鉤藤屬中藥材植物鑒定為鉤藤[Uncaria rhynchophylla （Miq.）Miq.ex Havil.]的初步結(jié)果，表明基于rDNA ITS序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的分子生物學方法可以快速準確地對鉤藤等藥物植物進行分子鑒定和遺傳分析。

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（收稿日期：2015-12-16 本文編輯：衛(wèi) 軻）