果雙雙，李　輝，施振旦，馬衛(wèi)明*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，南京 210014)

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脂多糖對(duì)體外培養(yǎng)豬顆粒細(xì)胞增殖、凋亡和雌二醇分泌的影響

果雙雙1，李輝2，施振旦2，馬衛(wèi)明1*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，南京 210014)

摘要：旨在探討脂多糖(LPS)對(duì)豬顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及雌二醇(E2)分泌的影響。采用不同濃度的LPS(0、500、1 000和2 000 ng·mL-1)處理體外培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞，并測(cè)定細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)基因FN1、IGF2、IGFBP2、CyclinD1、CyclinD2和P27kip的表達(dá)，同時(shí)對(duì)E2的分泌及P450arom的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，1 000或2 000 ng·mL-1LPS均可顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、提高活細(xì)胞百分率(P<0.05)。而500 ng·mL-1LPS即可促進(jìn)與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、周期相關(guān)基因FN1(P<0.01)，IGF2、IGFBP2(P<0.05)，CyclinD1、CyclinD2(P<0.01)的表達(dá)，抑制阻礙細(xì)胞周期的基因P27kip(P<0.01)的表達(dá)，同時(shí)可以通過(guò)強(qiáng)烈抑制芳香化酶P450arom基因的表達(dá)(P<0.01)，顯著抑制E2的分泌(P<0.01)。綜上表明，LPS可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制顆粒細(xì)胞分泌E2的功能。

關(guān)鍵詞：顆粒細(xì)胞；LPS；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；基因表達(dá)；E2

內(nèi)毒素化學(xué)本質(zhì)是脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，也是醫(yī)學(xué)上引起機(jī)體“發(fā)燒”的熱源。LPS在細(xì)菌正常生活狀態(tài)時(shí)并不釋放，僅在細(xì)菌自溶或人工方法裂解菌體后才釋放出來(lái)[1-2]。LPS在動(dòng)物體內(nèi)普遍存在，具有多種來(lái)源途徑，如環(huán)境、飼料、消化道內(nèi)細(xì)菌解體、患病、創(chuàng)傷、交配以及分娩過(guò)程等[3-5]。大多數(shù)內(nèi)毒素感染在初期并無(wú)明顯癥狀，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸表現(xiàn)出不良反應(yīng)[6-7]。LPS在生殖方面造成的不良影響主要表現(xiàn)為卵巢活動(dòng)受到抑制、類(lèi)固醇激素分泌能力下降、胚胎發(fā)育受阻、黃體機(jī)能降低、抑制胚胎著床和引發(fā)流產(chǎn)等[8-9]，最終導(dǎo)致動(dòng)物繁殖性能下降。在奶牛研究中，LPS可以通過(guò)影響動(dòng)物下丘腦-垂體促性腺激素的釋放而造成內(nèi)分泌紊亂，最終抑制LH/FSH分泌的脈沖波并能夠推遲或完全抑制排卵前高峰的出現(xiàn)[10-11]，阻礙E2分泌并抑制排卵。LPS對(duì)動(dòng)物繁殖活動(dòng)的影響，也表現(xiàn)在卵泡發(fā)育的方面。如具有正常周期性卵巢活動(dòng)的健康牛卵泡液中LPS含量很低，平均為(0.06±0.04)ng·mL-1，而患有子宮內(nèi)膜炎、缺乏周期性卵巢活動(dòng)的牛卵泡液中LPS含量很高，平均為(176.1±112) ng·mL-1，最高可達(dá)875.2 ng·mL-1[12]。

卵泡顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育和排卵過(guò)程中起著極其重要的作用，其通過(guò)微絨毛與卵母細(xì)胞發(fā)生內(nèi)分泌聯(lián)系，并對(duì)后者提供營(yíng)養(yǎng)支持。顆粒細(xì)胞通過(guò)不斷增殖、分泌類(lèi)固醇激素、分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、血管生成因子、免疫和趨化因子，促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育和成熟，并通過(guò)影響垂體促性腺激素的分泌進(jìn)行卵泡的募集、選擇和成熟排卵等[13]。有研究顯示，當(dāng)LPS作用于牛顆粒細(xì)胞時(shí)，能激活TLR-4并上調(diào)一系列炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNFα等的表達(dá)，同時(shí)抑制顆粒細(xì)胞E2的分泌[14-16]。LPS對(duì)動(dòng)物繁殖性能的負(fù)面影響，除通過(guò)下丘腦和垂體的間接作用降低促性腺激素分泌之外[17]，是否直接影響卵泡顆粒細(xì)胞增殖及其功能？為此本研究采用LPS直接處理離體培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞的方法，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞增殖、凋亡、相關(guān)基因表達(dá)及激素分泌水平等來(lái)闡明。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選取15～20頭180日齡左右的健康商品母豬，采集卵巢置于37 ℃生理鹽水中，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2豬顆粒細(xì)胞的原代培養(yǎng)

用無(wú)菌生理鹽水沖洗卵巢2～3次，滅菌紗布拭干卵巢表面，選取直徑>2 mm的卵泡，用10 mL注射器配10號(hào)針頭抽取卵泡液(注意避開(kāi)血管)。將收集的卵泡液置于37 ℃水浴中靜置5～10 min，收集上清離心，將收集到的細(xì)胞用PBS(Gibco)重懸兩次。用DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco)重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)·mL-1，添加含10%胎牛血清FBS(Gibco)，1%青鏈霉素(MP)的DMEM/F12培養(yǎng)基并置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后用PBS輕輕洗去未貼壁細(xì)胞，更換新鮮的含有10%FBS，1%青鏈霉素，豬垂體來(lái)源FSH(1 ng·mL-1，Sigma)，雄烯二酮(0.1 μmol·L-1，Sigma)且含有不同濃度LPS(0、500、1 000和2 000 ng·mL-1，Extracted fromE.coli055：B5，sigma)的新鮮培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激。E2測(cè)定組，在細(xì)胞培養(yǎng)24 h換液時(shí)，更換為含有2%FBS的上述培養(yǎng)液。

1.3細(xì)胞增殖檢測(cè)

LPS處理細(xì)胞48 h，利用CCK8試劑盒(上海翊圣)處理細(xì)胞[18-19]，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。其吸光度數(shù)值與細(xì)胞增殖成正比。

1.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)

LPS處理細(xì)胞48 h，用不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞，用FITC Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD Pharmingen)處理細(xì)胞，避光孵育15 min后，通過(guò)分析型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

在LPS處理細(xì)胞24及48 h時(shí)，分別利用細(xì)胞總RNA提取試劑盒(北京天根)提取細(xì)胞總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用ABI7500進(jìn)行qRT-PCR(試劑購(gòu)自Transgen Biotech)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖相關(guān)(FN1、IGF2、IGFBP2)，增殖周期相關(guān)(CyclinD1、CyclinD2、P27kip)以及芳香化酶P450arom基因的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

1.6E2測(cè)定

LPS處理細(xì)胞48 h后回收培養(yǎng)液，用PBS溶液1∶5進(jìn)行稀釋?zhuān)肊2定量測(cè)定試劑盒(北京北方生物)，采用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中E2含量，經(jīng)顯色后在酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值(OD值)，通過(guò)擬合濃度—吸光度曲線，計(jì)算出待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中E2含量。

表1qRT-PCR相關(guān)引物

Table 1Primers used in the real-time quantitative PCR assay

基因Gene登錄號(hào)Accessionnumber引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpLength退火溫度/℃Annealingtemperatureβ-actinXM_003357928.2F:CTTCCTGGGCATGGAGTCCR:GGCGCGATGATCTTGATCTTC20158FN1XM_003133641.2F:CTGCAAGCCCATAGCTGAGR:CACTGCCTTCTCCCAGAC13160IGF2NM_213883.2F:ACACCCTCCAGTTTGTCTGCGR:CAGCTACGGAAGCAGCACTCT10959IGFBP2NM_214003.1F:TTGCTGCCGCTGCTGCTGR:GTGCCCTCGCCCAGGAC33258CyclinD1NM_214088.1F:GCGAGGAACAGAAGTGCGR:TGGAGTTGTCGGTGTAGATGC19260CyclinD2NM_214088.1F:CATGTTCCTGGCGTCCAAGR:CGCCAGGTTCCACTTCAAC14260P27kipNM_214316.1F:TGACTCCATGAAAGGGACAR:CATCCAATGCTTTTAGAGGC10758P450aromNM_214431.1F:GCTGCTCATTGGCTTACR:TCCACCTATCCAGACCC18758

1.7統(tǒng)計(jì)分析

qRT-PCR統(tǒng)計(jì)結(jié)果以0添加組為對(duì)照，運(yùn)用2-△△Ct的方法計(jì)算各檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量，用內(nèi)參β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。數(shù)據(jù)處理采用SPSS Statistics 17.0的單因素方差分析，不同處理間的顯著性檢驗(yàn)采用Duncan式多重比較。采用Origin 8.6作圖。結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結(jié)果

2.1LPS 對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響

不同濃度LPS處理細(xì)胞48 h對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生的影響。由圖1可以看出，隨著LPS濃度的升高，反映細(xì)胞增殖活力的CCK8 OD值呈現(xiàn)出劑量依賴性上升趨勢(shì)，尤其當(dāng)添加濃度達(dá)到1 000和2 000 ng·mL-1時(shí)，細(xì)胞增殖顯著高于對(duì)照組及500 ng·mL-1處理組(P<0.01)。

(n=3，P<0.01)圖1　不同濃度LPS對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響Fig.1　Dose-effect of LPS on Granulosa cells proliferation

2.2LPS對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)分析型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，LPS可以一定程度地抑制細(xì)胞凋亡，且隨濃度的逐漸升高，凋亡細(xì)胞明顯減少。圖2顯示，經(jīng)LPS處理48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的顆粒細(xì)胞中活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞情況。圖2A～D顯示，隨LPS添加量逐漸升高，凋亡細(xì)胞逐漸減少(右上和右下兩個(gè)象限)，活細(xì)胞數(shù)逐漸增多(左下象限)。圖2E，F(xiàn)結(jié)果表明，添加1 000和2 000 ng·mL-1LPS濃度處理組的活細(xì)胞率顯著高于對(duì)照組及LPS濃度為500 ng·mL-1處理組(P<0.05)，添加1 000和2 000 ng·mL-1LPS濃度處理組間差異不顯著。LPS添加對(duì)培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞的總凋亡細(xì)胞百分率影響則恰恰相反。LPS添加濃度為1 000和2 000 ng·mL-1時(shí)，總凋亡細(xì)胞百分率處理組明顯低于對(duì)照組及LPS濃度為500 ng·mL-1處理組(P<0.05)。

A.空白對(duì)照組；B.500 ng·mL-1LPS；C. 1 000 ng·mL-1LPS；D.2 000 ng·mL-1LPS；E.活細(xì)胞百分率；F.凋亡細(xì)胞百分率(n=3)。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著。下同A.Blank control group；B.500 ng·mL-1LPS；C.1 000 ng·mL-1LPS；D.2 000 ng·mL-1LPS；E.Percentage of living cells；F.Percentage of apoptotic cells(n=3).Different small letters show significant difference (P<0.05).The same as below圖2　不同濃度LPS對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響Fig.2　Dose-effect of LPS on granulosa cells apoptosis

2.3LPS對(duì)顆粒細(xì)胞增殖及周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖3A顯示，LPS處理細(xì)胞24 h，與增殖相關(guān)的基因FN1、IGF2和IGFBP2，與周期相關(guān)的基因CyclinD1、CyclinD2和P27kip的相對(duì)表達(dá)量。圖3B顯示，LPS處理細(xì)胞48 h各基因的相對(duì)表達(dá)量。由圖3可知，LPS處理細(xì)胞24 及48 h能夠顯著上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因FN1(P<0.01，圖3A；P<0.05，圖3B)和IGF2(P<0.01)的相對(duì)表達(dá)量，且IGF2基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)劑量依賴性上調(diào)。LPS處理24 h顯著(P<0.05，圖3A)促進(jìn)IGFBP2的基因相對(duì)表達(dá)量，48 h差異不顯著(圖3B)。

圖3A顯示，促進(jìn)細(xì)胞周期的基因CyclinD1，CyclinD2在LPS處理24 h時(shí)，基因相對(duì)表達(dá)量差異不顯著，而圖3B顯示LPS處理48 h時(shí)兩基因相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01)。抑制細(xì)胞周期的基因P27kip在LPS處理24和48 h時(shí)都出現(xiàn)了極顯著下調(diào)(P<0.01)。

A.LPS處理24 h時(shí)各基因相對(duì)表達(dá)量；B.LPS處理48 h時(shí)各基因相對(duì)表達(dá)量。不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著。下同A.Relative expression ratio of genes treated by LPS for 24 h；B.Relative expression ratio of genes treated by LPS for 48 h.Different capital letters show extremely significant difference (P<0.01).The same as below圖3　不同濃度LPS對(duì)顆粒細(xì)胞增殖及周期相關(guān)基因表達(dá)的影響(n=9)Fig.3　Dose-effect of LPS on granulosa cells proliferation and cells cycle genes expression (n=9)

2.4LPS對(duì)顆粒細(xì)胞E2分泌和芳香化酶表達(dá)的影響

LPS處理顆粒細(xì)胞48 h后，測(cè)定培養(yǎng)液中E2結(jié)果見(jiàn)圖4A，LPS各處理組顆粒細(xì)胞E2分泌量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，各處理組間差異不顯著。與E2分泌相關(guān)的芳香化酶P450arom基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4B。經(jīng)LPS處理后，各處理組中P450arom基因相對(duì)表達(dá)量受到抑制，與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。

A.顆粒細(xì)胞E2分泌量(n=3)；B.P450arom基因表達(dá)量 (n=9)A.E2secretion of Granulosa cells(n=3)；B.Relative expression ratio of P450arom gene (n=9)圖4　不同濃度LPS對(duì)顆粒細(xì)胞E2分泌量和P450arom基因表達(dá)量的影響Fig.4　Dose-effect of LPS on Granulosa cells estradiol secretion and P450arom gene expression

3討論

在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，各種原因造成的微生物過(guò)度繁殖，使大量LPS進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，嚴(yán)重?fù)p害動(dòng)物的生產(chǎn)繁殖性能，帶來(lái)不可估量的經(jīng)濟(jì)損失[20-21]。本研究根據(jù)LPS對(duì)顆粒細(xì)胞增殖及E2分泌的直接影響，通過(guò)不同的試驗(yàn)手段，發(fā)現(xiàn)LPS處理離體豬顆粒細(xì)胞后，一定程度地促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡。促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因FN1、IGF2、IGFBP2及促進(jìn)細(xì)胞分裂周期的基因CyclinD1、CyclinD2的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上調(diào)，抑制細(xì)胞周期的基因P27kip顯著下調(diào)。以上基因的相對(duì)表達(dá)量變化說(shuō)明添加LPS對(duì)細(xì)胞增殖及周期的基因表達(dá)產(chǎn)生影響，從而引起細(xì)胞的增殖及凋亡。有研究報(bào)道顯示，LPS能夠促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞[22]、卵巢細(xì)胞[23]、小腸上皮細(xì)胞[24]等多種細(xì)胞的增殖。也有試驗(yàn)表明，LPS能夠促進(jìn)小鼠的睪丸支持細(xì)胞增殖[25-26]。在本研究中，LPS能夠顯著地促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，推測(cè)可能是LPS通過(guò)模式識(shí)別受體TLR-4途徑[7，27]激活下游NF-κB通路導(dǎo)致的。有相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)，LPS能夠經(jīng)由TLR-4途徑促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞[28]和肝癌細(xì)胞[29]等增殖。以及激活下游NF-κB通路導(dǎo)致細(xì)胞呈現(xiàn)增殖，這在Hela細(xì)胞研究中有所報(bào)道[30]，NF-κB也直接參與調(diào)控細(xì)胞的增殖凋亡基因的表達(dá)等[31-32]。NF-κB通路能夠促進(jìn)一系列抗炎因子及腫瘤壞死因子的表達(dá)[16]，其中，由TNFα介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑被激活，而LPS能夠通過(guò)激活NF-κB途徑抑制TNFα導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[33-34]，已經(jīng)在肝細(xì)胞[35]、角質(zhì)細(xì)胞[36]、內(nèi)皮細(xì)胞[37]等多種細(xì)胞中被證實(shí)。本研究通過(guò)CCK8和流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)LPS具有促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞增殖和抑制凋亡的作用，且與增殖及增殖周期相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果相吻合。

LPS在影響顆粒細(xì)胞的正常增殖凋亡程序時(shí)，也強(qiáng)烈地抑制顆粒細(xì)胞分泌E2的功能。P450arom由CyP19A1基因編碼，是雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，在顆粒細(xì)胞分泌E2中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠直接抑制其基因表達(dá)，導(dǎo)致E2分泌減少。此結(jié)果與K.Onnureddy[14]及T.Shimizu[15]等在牛顆粒細(xì)胞上得到的結(jié)果相似，證明LPS確實(shí)可以直接抑制顆粒細(xì)胞分泌E2的功能。而E2的正常分泌被抑制將導(dǎo)致動(dòng)物生殖內(nèi)分泌的紊亂，繼發(fā)一系列不良反應(yīng)。這一結(jié)果也解釋了因疾病或因環(huán)境問(wèn)題而引起的LPS感染所造成的安靜發(fā)情、斷續(xù)發(fā)情、卵泡發(fā)育受阻、排卵數(shù)下降、產(chǎn)后乏情、產(chǎn)仔數(shù)下降等現(xiàn)象。

4結(jié)論

LPS通過(guò)顆粒細(xì)胞的分子調(diào)控及基因表達(dá)影響其正常的增殖、凋亡，同時(shí)LPS可以直接抑制顆粒細(xì)胞分泌雌二醇。

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(編輯程金華)

Effects of Lipopolysaccharide on Proliferation，Apoptosis and Estradiol Secretion ofinvitroCultured Porcine Granulosa Cells

GUO Shuang-shuang1，LI Hui2，SHI Zhen-dan2，MA Wei-ming1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China；2.InstituteofAnimalScience，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing210014，China)

Abstract:In order to study the effects of Lipopolysaccharide(LPS) on proliferation，apoptosis and estradiol (E2) secretion of porcine granulosa cells.Primary porcine granulosa cells were culturedinvitroand treated by LPS at different concentrations (0，500，1 000 and 2 000 ng·mL-1).Then cell proliferation，apoptosis，secretion of E2and related gene expressions，F(xiàn)N1，IGF2，IGFBP2，CyclinD1，CyclinD2，P27kipandP450aromwere determined individually.The results showed that cell proliferation and survival ratio were significantly promoted at LPS concentrations of 1 000 or 2 000 ng·mL-1(P<0.05)，on the contrary，cell apoptosis was inhibited.However，gene expression levels ofFN1 (P<0.01)，IGF2，IGFBP2 (P<0.05)，CyclinD1 andCyclinD2 (P<0.01) were up-regulated at 500 ng·mL-1of LPS，P27kip(P<0.01) which hindered cell cycle was inhibited.P450aromgene expression was decreased，resulting the inhibition of E2secretion when treated by LPS.These results suggested that granulosa cell proliferation could be promoted by LPS，while cell apoptosis and E2secretion were inhibited.

Key words:granulosa cells；LPS；cell proliferation；cell apoptosis；gene expression；E2

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.008

收稿日期：2015-09-25

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金(BK20151365)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31402080)；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)[ZX(15)4031]

作者簡(jiǎn)介：果雙雙(1989-)，女，山東濟(jì)南人，碩士生，主要從事動(dòng)物繁殖內(nèi)分泌學(xué)研究， E-mail: qicaitianping7777@163.com *通信作者：馬衛(wèi)明，副教授，E-mail: mawm@sdau.edu.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：S828；S814.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)04-0693-07