文昌雞性成熟啟動前后下丘腦c-Myc/LIN28B/let-7a通路表達規(guī)律分析

韓　威，蘇一軍，朱云芬，李國輝，張會永，殷建玫，王克華，鄒劍敏

(中國農業(yè)科學院家禽研究所 國家級地方雞種基因庫，揚州 225125)

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文昌雞性成熟啟動前后下丘腦c-Myc/LIN28B/let-7a通路表達規(guī)律分析

韓威，蘇一軍，朱云芬，李國輝，張會永，殷建玫，王克華，鄒劍敏*

(中國農業(yè)科學院家禽研究所 國家級地方雞種基因庫，揚州 225125)

摘要：本研究旨在分析c-Myc/LIN28B/let-7a調節(jié)通路與雞性成熟啟動的關聯(lián)。測定5～17周齡文昌雞母雞卵巢重量、最大卵泡直徑、輸卵管長度及冠大小的發(fā)育性變化，并采用qRT-PCR檢測c-Myc/LIN28B/let-7a基因在性成熟啟動前后下丘腦中的表達。結果表明，在發(fā)育早期，文昌雞性腺組織發(fā)育緩慢，卵泡保持原始狀態(tài)。12周齡后，性腺組織進入快速發(fā)育期，13周齡母雞的卵巢重量(1.35 g)和輸卵管長度(15.68 cm)與12周齡測量值(0.60 g，7.16 cm)相比分別增加了125%和120%，同時出現(xiàn)等級前小白卵泡(SWF，直徑1.0～2.0 mm)或大白卵泡(LWF，直徑3.0～5.0 mm)，由此確定，12～13周齡為文昌雞母雞的性成熟啟動關鍵時機。qRT-PCR檢測表明，c-Myc、LIN28B基因在文昌雞性成熟啟動時，下丘腦組織中的表達水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且c-Myc基因的低表達能夠持續(xù)到開產(chǎn)，而LIN28B基因表達水平在開產(chǎn)前(15周齡)又恢復至較高水平；性成熟啟動后let-7a表達水平顯著升高(P<0.01)，并持續(xù)至開產(chǎn)。綜上表明，c-Myc→LIN28B┤let-7a通路參與雞性成熟啟動調節(jié)。

關鍵詞：文昌雞；性成熟啟動；下丘腦；基因表達

性早熟(Precocious puberty)在人類表現(xiàn)為病理狀態(tài)，而在家禽生產(chǎn)上則是一個具有重要經(jīng)濟價值的性狀[1]。中國地方雞品種資源的早熟特性十分明顯，如蛋用型的白耳黃雞、仙居雞，肉用型的文昌雞、廣西三黃雞等開產(chǎn)日齡大都在110～120 d，比國外品種提前20 d以上。開展雞性成熟調控機制研究，對于高產(chǎn)蛋雞和優(yōu)質肉雞育種具有重要意義。性成熟啟動(Puberty onset)是個復雜的生物學過程，受遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)等因素的共同調節(jié)，哺乳動物和人類遺傳學研究為肯定遺傳因素的調控作用提供了有力證據(jù)[2-3]。通過全基因組關聯(lián)分析(Genome-wide association analysis，GWAS)，研究者發(fā)現(xiàn)多個性早熟調節(jié)候選基因系統(tǒng)，包括KISS1/GPR54[4-5]、LIN28[6]、NKB[7]及MKRN3印記基因等[8-9]，大大加深人們對性成熟啟動的神經(jīng)內分泌調控和遺傳決定機制理解。性成熟啟動受多基因網(wǎng)絡調控，沒有孤立的基因或通路獨立地負責性成熟啟動過程[10-11]。越來越多的證據(jù)表明，性成熟啟動可能不會提早發(fā)生，性成熟啟動基因的轉錄抑制可能起重要作用。近年來，研究者基于高通量基因組學數(shù)據(jù)，借助生物信息學分析初步構建性成熟啟動的多層次等級轉錄調控網(wǎng)絡[12-13]，為理解性成熟啟動的調控機制注入新見解。而構成該網(wǎng)絡核心的c-Myc/LIN28/let-7通路還缺乏足夠的試驗支持，尤其是缺乏禽類研究證據(jù)，相關同源基因在禽類性成熟啟動進程中的表達規(guī)律尚未被清晰闡述。下丘腦是調節(jié)性成熟進程的關鍵組織，本研究利用qRT-PCR方法檢測該通路基因在性成熟啟動前、后文昌雞下丘腦中的表達變化規(guī)律，為解析多層次等級基因轉錄抑制在性成熟啟動中的調控作用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

文昌雞來源于國家級地方雞種基因庫保種群，上籠母雞人工授精后，連續(xù)收集10～12 d種蛋孵化，人工鑒定雛雞性別，隨機選留母雞個體。在常規(guī)標準化飼養(yǎng)管理條件下，飼喂至17周齡，分育雛、育成和產(chǎn)蛋3個階段，全程飼喂全價配合飼料(嘉吉飼料(鎮(zhèn)江)有限公司)，自由采食和飲水。

1.2不同周齡雞冠和性腺組織發(fā)育度量

5～17周齡，每周選取母雞個體10個，屠宰后測定雞冠大小、卵泡大小、卵巢重量和輸卵管長度。冠和卵泡大小測量使用游標卡尺，卵巢重量測量使用電子稱，輸卵管長度測量采用皮尺。冠高：指第2齒尖至基部的垂直距離。冠長：指冠基部最前端～最后端的直線距離。輸卵管長度：指漏斗管部～泄殖腔部的直線(自然伸展)距離。

1.3下丘腦組織樣采集

選擇用于性腺組織發(fā)育度量的11～15、17周齡母雞個體(每組6個/10個)，屠宰后按照鳥類腦部組織結構分離下丘腦組織，液氮保存。

1.4組織RNA提取和質量檢測

mRNA定量分析的總RNA，按照Trizol試劑盒(SK1311，上海生工生物工程有限公司)說明進行提取，用于miRNA定量分析的小RNA，采用miScript II RT kit(QIAGEN，USA)試劑盒提取。分光光度計檢測OD260 nm/OD280 nm值，瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性。

1.5qRT-PCR定量分析

c-Myc和LIN28B基因相對定量：反轉錄第一鏈cDNA合成采用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit(SK2445)試劑盒。PCR擴增引物序列見表1，GAPDH基因做內參。20 μL反應體系：SybrGreen qPCR Master Mix(2×)10 μL，引物F (10 μmol·L-1) 1 μL，引物R (10 μmol·L-1) 1 μL，ddH2O 6 μL，Template (cDNA) 2 μL。反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，40個循環(huán) 。

let-7a相對定量：snRNAU6做內參，U6逆轉錄引物、let-7a莖環(huán)特異性引物及PCR擴增引物見表2。反轉錄體系(5 μL)：變性總 RNA和RT primer (2 μmol·L-1) 3.0 μL，5×PrimeScript?Buffer 1.0 μL，RNase Free dH2O 0.6 μL，PrimeScript?RT Enzyme Mix I 0.4 μL。反應程序：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。PCR擴增體系(20 μL)：2×SYBR Green Mix With ROX 10.0 μL，ddH2O 8.2 μL，Primer mix (10 μmol·L-1) 0.8 μL，RT product 1 μL。反應程序為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，39個循環(huán)。每個樣品3次重復。

表1qRT-PCR檢測基因引物序列

Table 1Primer sequences for qRT-PCR

基因Gene登錄號Accessionnumber引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物長度/bpLengthLIN28BGalluslin-28homologB(C.elegans)NM_001034818.1F:GCCTAAAAGAAGGAGAACCAGTGR:TTGGGTCGTCTTTCACTTCCT117c-MycGallusmyelocytomatosisviraloncogenehomologNM_001030952.1F:AAGAGGCTAAAGTTGGACAGTGGR:CGCAGGGCAAAGAAACTCA166GAPDHGallusglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseNM_204305.1F:ACTGTCAAGGCTGAGAACGGR:GGTCACGCTCCTGGAAGATA269

表2miRNA qRT-PCR檢測引物信息

Table 2Primer sequences forlet-7 miRNA qRT-PCR

miRNA/內參Assayname莖環(huán)逆轉錄引物(5'-3')Stem-loopedRTprimer上游引物(5'-3')Forwardprimer下游引物(5'-3')Reversedprimer產(chǎn)物長度/bpLengthgga-let-7aGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-ATTCGCACTGGATACGACAACTATGGCGGTGAGGTA-GTAGGTTGTCAGTGCAGGGTC-CGAGGTAT63gga-U6CCATATTAGAAGCCCCTTTTTGTTAAGCCTGGA-CTGAGTAAGAGCGCCATATTAGAAG-CCCCTTTTTGT209

1.6數(shù)據(jù)處理

根據(jù)2-△△CT方法計算基因相對表達水平。性狀和表達水平比較分析，采用SPSS20.0單因素方差分析one-way AVOVA LSD進行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結果

2.1不同周齡性腺組織發(fā)育性變化

5～17周齡文昌雞母雞雞冠、卵泡和性腺組織的發(fā)育性變化見表3。結果表明，早期性腺組織發(fā)育緩慢，卵泡保持原始狀態(tài)，這一過程約持續(xù)12周。12周齡后，性腺組織進入快速發(fā)育期，13周齡母雞的卵巢重量(1.35 g)和輸卵管長度(15.68 cm)與12周齡測量值(0.60 g，7.16 cm)相比，分別增加了125%和120%(P<0.01)，同時出現(xiàn)等級前小白卵泡(SWF，直徑1.0～2.0 mm)或大白卵泡(LWF，直徑3.0～5.0 mm)。另一個顯著的外在表型變化，就是母雞眼瞼周圍的皮膚顏色由黃色或淡紅色轉變成深紅色。約20～30 d后，母雞即可達到性成熟并產(chǎn)下第1個蛋(開產(chǎn))?；谏鲜鲋笜?，判定文昌雞性成熟啟動時期為12～13周齡。

2.2擴增片段檢測和克隆測序

提取的組織總RNA經(jīng)分光光度計檢測，OD260nm/OD280nm為1.8～2.0，表明總RNA保持完整。LIN28B、c-Myc和let-7aPCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(圖略)，結果表明，擴增片段長度大小與引物設計相一致。LIN28B和c-Myc基因PCR產(chǎn)物克隆測序見圖1，通過序列比對，測定序列與GenBank中雞相應基因的核苷酸序列相一致。

2.3基因表達水平分析

LIN28B、c-Myc基因和let-7a在性成熟啟動前后下丘腦中的相對表達水平見圖2。結果表明，性成熟啟動轉變時(12～13周齡)，c-Myc和LIN28B基因的表達水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且c-Myc基因的低表達能夠持續(xù)到開產(chǎn)，而LIN28B基因表達水平在開產(chǎn)前(15周齡)又恢復至較高水平。與之相反，let-7a的表達水平顯著升高(P<0.01)，并持續(xù)至開產(chǎn)。

表3不同發(fā)育時期雞冠和性腺組織度量(n=10)

Table 3Measurement of comb size and gonad tissues during different development stages(n=10)

A.LIN28B基因；B.c-Myc基因A.LIN28B gene；B.c-Myc gene圖1　檢測基因PCR擴增片段序列Fig.1　Sequences of gene PCR products

小寫字母表示P<0.05；大寫字母表示P<0.01Lowercase letters indicated P<0.05；Capital letters indicated P<0.01圖2　不同發(fā)育階段LIN28B、c-Myc基因和let-7a的相對表達水平Fig.2　Relative expression levels of LIN28B，c-Myc genes and let-7a in different development phases

3討論

3.1文昌雞性成熟啟動度量

性成熟調控機制研究中，一個重要的前提條件是能夠準確地度量性成熟啟動時期及其進程。在過去的十年里，還沒有出現(xiàn)新的性成熟度量方法[14]。人類上，“Tanner分期”(按青春期性發(fā)育的特征將生殖系統(tǒng)的發(fā)育分為5期，用于臨床評估)仍是最經(jīng)典的性成熟分級方法，TannerⅡ期的陰毛出現(xiàn)(Pubarche)和乳房初發(fā)育(Thelarche)為青春期啟動的標志，初潮期(Age at menarche)是青春期最顯著標志。陰門開啟(Vaginal opening，VO)被視為雌性哺乳類動物性成熟啟動的標志[15-16]。生殖激素水平測定也常被用于度量性成熟階段[17-18]。

與哺乳動物和人類相比，禽類的生殖活動具有不同的特點。母雞在4～5月齡達到性成熟，并開始產(chǎn)蛋，開產(chǎn)是青春期完成和性成熟的標志[19]。母雞沒有初情期和發(fā)情周期。盡管研究者針對禽類性成熟過程的生理學特征開展了廣泛的研究[20]，然而迄今為止，還沒有系統(tǒng)的方法能夠用于度量雞的性成熟階段。母雞在性發(fā)育過程中能被直接觀測到的外在特征主要有冠的大小和顏色、體重變化，但是這些指標難以精確度量性成熟啟動及進程。性腺的發(fā)育狀態(tài)是機體性成熟發(fā)育進程的最直接體現(xiàn)，在本研究首先測定母雞性腺組織5～17周齡持續(xù)發(fā)育性變化，結果表明進入13周齡后，文昌雞母雞的卵巢、輸卵管、卵泡呈現(xiàn)“迸發(fā)式”快速發(fā)育，代表了生殖狀態(tài)改變的一個重要轉折時期。另外，本研究也測定了性成熟前后不同發(fā)育階段母雞血清LH水平，結果與已有的報道相類似，LH水平的增加與性腺組織的快速發(fā)育相一致。雖然基于不同發(fā)育階段LH平均水平可以度量雞性成熟啟動及其進程，但是難以精確區(qū)別單個個體的性發(fā)育狀態(tài)，因為測定值在不同發(fā)育階段、同一發(fā)育階段不同個體間存在重疊和較大變異，這也是未使用LH水平作為度量指標的主要原因。在以后研究中尋找新的更精確的標記，如循環(huán)miRNA[21]用于性成熟度量是非常必要的。

因此，基于性腺發(fā)育指標確定了12～13周齡為文昌雞母雞的性成熟啟動關鍵時期，這為開展性成熟啟動相關研究提供了前提基礎。

3.2c-Myc/LIN28B/let-7a通路與雞性成熟啟動

LIN28和let-7是線蟲幼蟲發(fā)育的異時性調節(jié)因子，LIN28基因編碼一種RNA結合蛋白，抑制let-7 miRNA前體向成熟miRNA的轉變。LIN28/let-7通路調節(jié)功能多樣化，與癌癥、胚胎發(fā)育、老化、糖代謝等過程密切相關[22-23]。此外，越來越多的研究表明，LIN28/let-7通路參與性成熟啟動時期的決定。漸增的LIN28表達會導致線蟲發(fā)育延遲，人類LIN28B基因與初潮期提前相關[24-25]，LIN28a過表達小鼠初情期啟動延遲[26]。研究還發(fā)現(xiàn)，LIN28/let-7通路的調節(jié)性成熟啟動時期作用存在性別差異，LIN28b對雄性小鼠的調節(jié)作用可能強于雌性小鼠，而且這種調節(jié)可能部分地獨立于let-7。提示LIN28/let-7通路可能還包括其他功能組分。

已知的MYC家族成員至少有3個：C-Myc、N-Myc和L-Myc。C-Myc基因是禽類髓細胞病毒MC-29的V-Myc同源基因，其腫瘤發(fā)生作用是三者中最強的。C-Myc蛋白在結構上包含轉錄激活區(qū)和DNA結合區(qū)，能作為轉錄因子激活或抑制下游靶基因的轉錄，是哺乳動物體尺和代謝作用的重要調節(jié)因子[26]。研究已證實MYC作用于LIN28基因的上游，是LIN28基因的正向調節(jié)因子，同時let-7也能靶向MYC基因[26]，形成了一個反饋環(huán)。S.Alvarellos等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在幼年期～青年期發(fā)育轉變大鼠的下丘腦中，LIN28、LIN28B和c-Myc的表達水平顯著降低，至青春期前期達到最低水平；而let-7a、let-7b(還包括miR-132、miR-145)表達則顯著增加，c-Myc/LIN28B/let-7通路的表達變化在青春期延遲模型中也被發(fā)現(xiàn)。

本研究qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，c-Myc、LIN28B基因在文昌雞性成熟啟動關鍵轉變時期(12～13周齡)下丘腦組織中的表達水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且c-Myc基因的低表達能夠持續(xù)到開產(chǎn)，而LIN28B基因表達水平在開產(chǎn)前(15周齡)又恢復至較高水平；與之相對應的是，性成熟啟動后let-7a表達水平顯著升高，研究結果與哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的c-Myc→LIN28┤let-7(→表示促進作用，┤表示抑制作用)表達變化模式相一致，初步表明，該調控通路與性成熟啟動調節(jié)相關。

4結論

c-Myc/LIN28B/let-7a通路參與文昌雞性成熟啟動調節(jié)。

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(編輯程金華)

Analysis on Changes of Hypothalamic c-Myc/LIN28B/let-7a Pathway Transcription during Puberty Onset in Wenchang Chicken

HAN Wei，SU Yi-jun，ZHU Yun-fen，LI Guo-hui，ZHANG Hui-yong，YIN Jian-mei，WANG Ke-hua，ZOU Jian-min*

(NationalChickensGeneticResources，PoultryInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Yangzhou225125，China)

Abstract:This experiment was conducted to investigate the role ofc-Myc/LIN28B/let-7apathway in chicken puberty onset.The Wenchang chicken breed was used as the material.The comb size，ovary weight，oviduct length and follicle size for hens were measured from 5 to 17 weeks.qRT-PCR was performed to analyze the hypothalalmic expression changes ofc-Myc/LIN28B/let-7apathways.The results showed that：1) The ovary and oviduct developed slowly and the follicles kept primitive in early period of development in Wenchang chicken.This period would last about 12 weeks.Then，the gonad tissues developed explosively，the ovary weight and oviduct length of 13 weeks increased 125% and 120% respectively compared to that of 12 weeks，and accompanied by emergence of pre-hierarchical follicles.Based on these，the crucial “timing” for transition from juvenile to puberty onset for Wenchang hens was determined as age of 13 weeks.2) qRT-PCR test revealed the relative expression levels ofc-MycandLIN28Bgenes in hypothalamus decreased significantly (P<0.05，P<0.01) at the transition timing of puberty onset in Wenchang chicken.The lower level ofc-Myccould last to the age of first laying，but that ofLIN28Brecovered to higher level before the age of first laying.Accompanied with these changes was the significant increase oflet-7a(P<0.01)，which could kept higher until the age of first laying.These results indicated thatc-Myc→LIN28B┤let-7aregulating pathway was involved in chicken puberty onset.

Key words:Wenchang chicken；puberty onset；hypothalamus；gene expression

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.010

收稿日期：2015-10-14

基金項目：國家自然科學基金項目(31201799)；江蘇省農業(yè)三新工程項目(SXGC[2015]300)；江蘇省農業(yè)科技創(chuàng)新項目(CX[15])1009)

作者簡介：韓威(1980-)，男，徐州睢寧人，副研究員，博士，主要從事家禽資源保護與評價研究，E-mail：hanwei830@163.com，Tel：0514-86587763 *通信作者：鄒劍敏，研究員，E-mail：jqszjm@163.com

中圖分類號：S831.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0709-07