雙黃連聯(lián)合萬古霉素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物被膜抑制作用的研究

張彩萍 謝家祺 濮 娜 倪宏偉 吳 瑩*

（大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院ICU，遼寧 大連 116021）

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雙黃連聯(lián)合萬古霉素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物被膜抑制作用的研究

張彩萍 謝家祺 濮 娜 倪宏偉 吳 瑩*

（大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院ICU，遼寧 大連 116021）

【摘要】目的 研究雙黃連聯(lián)合萬古霉素對MRSA生物被膜的影響。方法 平板培養(yǎng)法培養(yǎng)MRSA生物被膜，銀染法鑒定。96孔平板培養(yǎng)，分為四組：空白對照組（A組）、雙黃連組（B組）、萬古霉素組（C組）、雙黃連+萬古霉素組（D組）。經(jīng)上述不同藥物對生物被膜處理后，比色法測定藻酸鹽含量，MTT法測定各組活菌計數(shù)。結(jié)果 ①B、C、D組作用后藻酸鹽含量明顯低于A組（P＜0.05），D組分別較B組及C組低（P＜0.05）；②B、C、D組作用后活菌計數(shù)明顯低于A組（P＜0.05），D組活菌計數(shù)亦分別較B組及C組低（P＜0.05）。結(jié)論 雙黃連可抑制MRSA生物被膜合成，并有顯著抑菌作用，與萬古霉素有協(xié)同作用。

【關(guān)鍵詞】生物被膜；MRSA；雙黃連；萬古霉素

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）感染已被公認(rèn)為世界范圍內(nèi)的三大最難解決的感染性疾病之一，且其耐藥性越來越嚴(yán)重[1]。傳統(tǒng)的糖肽類抗生素（如萬古霉素、替考拉寧等）對于MRSA的敏感性及臨床療效逐年降[2]。而導(dǎo)致MRSA耐藥的重要機(jī)制之一即生物被膜（Biofilm）形成，生物被膜是指附著在有生命體或無生命體表面的由細(xì)菌自身產(chǎn)生的胞外多聚基質(zhì)包裹的菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)群體。成熟生物被膜包裹的細(xì)菌較浮游狀態(tài)細(xì)菌對抗生素的敏感性降低10～1000倍[3]。而近年研究表明，中藥在這一領(lǐng)域具有獨特優(yōu)勢[4]。本研究旨在觀察雙黃連聯(lián)合萬古霉素對MRSA生物被膜的抑制作用[4]，為解決MRSA感染這一難題提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株：采用金黃色葡萄球菌（MRSA）ATCC33591菌株（豐壽上海生物科技有限公司）。

1.2 抗菌藥物：注射用鹽酸萬古霉素（禮來蘇州制藥有限公司）；注射用雙黃連（哈藥三精）。

1.3 實驗方法

1.3.1 MIC（最低抑菌濃度）值測定：采用微量肉湯稀釋法分別測定萬古霉素及雙黃連單獨應(yīng)用對受試菌株生物被膜形成前后的MIC值。

1.3.2 MRSA生物被膜的建立與鑒定：①生物被膜的建立：取過夜培養(yǎng)的MRSA，用MH肉湯配置成1×106cfu/mL菌懸液，加入96孔板中，同時每孔中放入已高壓滅菌的硅膠片，35 ℃溫箱中培養(yǎng)，每48 h更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)7 d后即可形成穩(wěn)定的生物被膜。②快速銀染法鑒定生物被膜：經(jīng)滅菌生理鹽水多次充分漂洗，去掉浮游菌；2.5%戊二醛PBS溶液固定，飽和CaCl2溶液結(jié)合5% AgNO3染色，1%對苯二酚溶液顯色，5%NaS2O3溶液固定，樣品經(jīng)過上述處理后，若呈灰黑色，則可鑒定為細(xì)菌生物被膜[5]。

1.3.3 分組：采用96孔平板進(jìn)行藥物實驗，按照所加藥物不同，菌液分為4組，每組15孔。分組如下：①空白對照組（蒸餾水）；②雙黃連組；③萬古霉素組；④雙黃連+萬古霉素組。每孔均加入菌懸液100 μL，實驗藥物100 μL，藥物濃度均采用1 MIC，即每種藥物的最低抑菌濃度。

1.3.4 以藻酸鹽含量測定各組藥物對MRSA生物被膜合成的影響[6]：取經(jīng)過各藥物處理的MRSA菌液100 L1（106cfu/mL），加入表面鋪有濾膜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，表面生長物加入2 mL生理鹽水中，震蕩均勻，離心7000 r/min，10 min除去細(xì)菌，取0.5 mL上清液0.95% Na2B4O7?10H2O/H2SO4中，冰浴混勻，加熱至100 ℃，10 min，冰浴冷卻，再加入0.1 mL 0.125% 咔唑/乙醇，混勻加熱至100 ℃，15 min，冰浴冷卻至室溫，酶標(biāo)儀530 nm處測OD值，標(biāo)準(zhǔn)曲線通過葡萄糖醛酸內(nèi)酯經(jīng)同樣處理繪制。

1.3.5 藥物對存活細(xì)菌數(shù)的影響[9]：①活菌計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取過夜培養(yǎng)的MRSA，調(diào)節(jié)至0.5麥?zhǔn)蠞舛龋?倍倍比稀釋8次，各取100 L1入96孔板，加入MTT 20 L1，35 ℃培育3 h，加入裂解液終止反應(yīng)，0.5 h后酶標(biāo)儀595 nm處測定OD值，以此為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。②藥物對存活細(xì)菌數(shù)的影響：取出培養(yǎng)好的硅膠片，無菌蒸餾水沖洗后，置入含有各藥物及對照組的96孔平板中，35 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，MTT法測定各組OD值，標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)活菌計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法：藻酸鹽濃度及存活細(xì)菌數(shù)量均為計量資料，組間比較采用單因素方差分析。 SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生物被膜形成前后各藥物的MIC值：萬古霉素對于MRSA質(zhì)控菌株生物被膜形成前后的MIC值為1 μg/mL vs 3.4 μg/mL；雙黃連對于MRSA質(zhì)控菌株生物被膜形成前后的MIC值為8.6 μg/mL vs 15.2 μg/mL。

2.2 銀染法鑒定生物被膜：可見視野內(nèi)灰黑色生物被膜覆蓋，層次多，致密，偶可見球菌形態(tài)。

2.3 在MRSA生物被膜形成過程中進(jìn)行干預(yù)對藻酸鹽含量的影響：組間兩兩比較均具有顯著性差異。分述如下：與空白對照組相比，雙黃連組、萬古霉素組、雙黃連+萬古霉素組藻酸鹽含量均降低，差別有顯著性（P值均＜0.05）。三組組間比較亦有顯著性差異，其中以雙黃連+萬古霉素組藻酸鹽含量最低（P＜0.05），萬古霉素組則較雙黃連組低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組藻酸鹽含量測定結(jié)果

2.4 MRSA生物被膜形成后，藥物干預(yù)對存活細(xì)菌數(shù)的影響：①MTT活菌計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=8.21x-1.33，r=0.9981，線性范圍為4.5 ×104～1.7×108cfu/mL。②組間比較均有顯著性差異，其中：雙黃連組、萬古霉素組、雙黃連+萬古霉素組活菌懸液濃度與空白對照組相比均減低，差別有顯著性（P值分別為0.001、0.001和0.001）；雙黃連+萬古霉素組活菌懸液濃度分別較雙黃連組、萬古霉素組均降低，差別有顯著性（P值分別為0.001和0.015）。萬古霉素組與雙黃連組比較，活菌濃度降低，差別有顯著性（P值為0.001）。見表2。

表2 各組活菌計數(shù)測定結(jié)果

3 討 論

MRSA感染主要涉及皮膚軟組織、肺炎、血行感染及骨關(guān)節(jié)感染，其中以醫(yī)院獲得性感染較為多見，與侵入性操作（特別是中心靜脈導(dǎo)管、假體等植入物）密切相關(guān)[1，6]。但近年來，社區(qū)獲得性MRSA感染亦成增加趨勢[7]。一旦發(fā)生MRSA感染，患者病死率、致殘率及醫(yī)療費用均大幅增加。目前，糖肽類抗菌藥物萬古霉素、替考拉寧仍然是治療MRSA的最有效藥物[8]。但自從日本報道了全球第一例萬古霉素敏感性降低的金黃色葡萄球菌，這種情況有所改變[10]。2002年6月在美國又報道了第一例萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌[10]（Vancomycin-resistant Staphylococcusaureus，VRSA）。國內(nèi)研究中也有對萬古霉素、替考拉寧中介敏感的金黃色葡萄球菌報道。而生物被膜形成則是MRSA耐藥性的形成的重要機(jī)制之一[11，13]。

生物被膜（biofilm）也稱為菌膜（Bacterial biofilm），是指細(xì)菌在不利于其生長的環(huán)境下產(chǎn)生藻酸鹽多糖，使細(xì)菌相互粘連形成膜狀附著于病灶表面或?qū)Ч軆?nèi)，可引起一系列病理改變。臨床上特別是ICU病房常見的致病菌包括銅綠假單胞菌、不動菌屬、葡萄球菌（包括MRSA）、腸桿菌、真菌等均易產(chǎn)生生物被膜，使細(xì)菌抵御抗菌藥物的殺傷和逃逸宿主的免疫，從而導(dǎo)致臨床相關(guān)感染的難治性[11-15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，MRSA生物被膜形成后，抗菌藥物MIC值明顯升高，提示抗菌活性下降。抑制生物被膜形成，對于改善MRSA耐藥問題及萬古霉素的臨床療效有重大意義。

在第二階段的研究中，我們發(fā)現(xiàn)萬古霉素及雙黃連均有抑制MRSA生物被膜形成的作用，且有明顯協(xié)同作用。分析其原因，可能與兩種藥物本身的抗菌活性有關(guān)[16]，活菌數(shù)量減少，BF形成減少，藻酸鹽含量減少。具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究闡明。但可提示臨床早期聯(lián)合用藥的可行性。

在第三階段研究中，發(fā)現(xiàn)雙黃連本身即具有一定的抗MRSA抗菌活性，而與萬古霉素合用后，協(xié)同作用明顯。考慮與雙黃連增加萬古霉素向細(xì)菌體內(nèi)的滲透性有關(guān)。其具體機(jī)制亦有待進(jìn)一步研究闡明。此部分研究結(jié)果與其他研究中中藥制劑（如魚腥草、黃芩等）亦具有一定的抗MRSA或銅綠假單胞菌活性的結(jié)果一致[4，12]。都證明中西醫(yī)結(jié)合治療感染性疾病的可行性。

此外，本研究的局限性在于實驗全程均采用試劑公司購置的MRSA質(zhì)控菌株，雖保證樣本生物特性的一致性，但其與臨床感染標(biāo)本中分離出的MRSA仍有不同[17-18]。故其臨床應(yīng)用性仍待進(jìn)一步研究完善。

綜上，在體外實驗中，雙黃連聯(lián)合萬古霉素能顯著抑制MRSA生物被膜的形成，同時，二者對于MRSA具有顯著的協(xié)同抗菌作用。這將為臨床MRSA感染提供一個新方向。

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中圖分類號：R969.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）07-0001-03

基金項目：大連市衛(wèi)生局科技自主創(chuàng)新與普及推廣項目（2011-95）

*通訊作者：E-mail：676893314@163.com

T he Effect of Shuanghuanglyan and V ancom ycyn on Byofylm of M ethycyllyn-resystant Staphylococcus A ureus（M R SA）

ZHANG Cai-ping, XIE Jia-qi, PU Na, NI Hong-wei, WU Ying*
（Department of ICU， Affliated Xinhua Hospital of Dalian University， Dalian 116021， China）

[Abstract]Objective To observe the effect of Shuanghuanglian and vancomycin on the biofilm of MRSA. Methods Modified plate culture method was used to establish in vitro bacterial biofilm model， which was identified by silver nitrate staining. The bacteria were cultured in 96 hole plate and divided into four groups： blank control group （group A）， shuanghuanglian group（group B）， vancomycin group（group C）， V+S group（group D）. After the biofilm was treated by vancomycin and/or shuanghuanglian， alginate content was detected by colorimetric method and the number of viable bacteria was measured by MTT method. Results ①The alginate content of groupB， C， D was significantly lower than group A （P＜0.05）， and which of the group D was lowest. ②The number of viable bacteria of group B， C， D was significantly lower than group A （P＜0.05）， and which of the group D was lowest too. Conclusion Shuanghuanglian can inhibit synthesis of MRSA biofilm， and has significant inhibitory effect which showed synergistic effect with vancomycin.

[Key words］Biofilm； MRSA； Shuanghuanglian； Vancomycin