朱麗媛 甄 莉

（山西省太原市山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001）

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大皰性類天皰瘡皮損部位HBD-2表達(dá)的研究

朱麗媛 甄 莉

（山西省太原市山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001）

【摘要】目的 通過研究人類β-防御素2（HBD-2，human beta-2 defensin）在大皰性類天皰瘡中的表達(dá)水平，探討其在大皰性類天皰瘡發(fā)病和預(yù)后中的作用。方法 選取20例病理診斷為大皰性類天皰瘡（BP）皮損，陽性對(duì)照組選取20例尋常性銀屑病患者皮損部位，陰性對(duì)照組選取20例正常成人皮膚組織。用免疫組化（SP）法檢測HBD-2在各組標(biāo)本的石蠟切片中的表達(dá)部位及水平。選擇平均灰度值作為參考數(shù)據(jù)，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間對(duì)照選用秩和檢驗(yàn)，以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 ①β-防御素的表達(dá)：正常皮膚組織的免疫組化染色基底層可見少量HBD-2的表達(dá)，BP患者皮損的基底層、棘層、顆粒層可見HBD-2的表達(dá)，銀屑病患者皮損處基底層、棘層、顆粒層可見HBD-2的表達(dá)。②HBD-2在BP表皮中的表達(dá)，比正常皮膚高（Z=-10.892，P<0.001），比銀屑病皮損高（Z=-5.385，P<0.001）。結(jié)論 大皰性類天皰瘡的發(fā)病可能 HBD-2有關(guān)，大皰性類天皰瘡的免疫調(diào)節(jié)過程可能有HBD-2的參與。

【關(guān)鍵詞】大皰性類天皰瘡；防御素-2；銀屑病

大皰性類天皰瘡（BP）是一種表皮下大皰病，有自身抗原形成，好發(fā)于老年人。主要特征是皰壁厚、緊張不易破，組織病理表現(xiàn)為表皮下水皰，且好發(fā)于胸腹部和四肢近端。目前病死率較高 ，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。大部分學(xué)者傾向于認(rèn)為BP為一種自身免疫性疾病[1]。近來研究表明，β-防御素2促進(jìn)機(jī)體T細(xì)胞的趨化和增殖，參與特異性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)生物機(jī)體主動(dòng)抵抗外來微生物的侵害，還具有促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放炎性介質(zhì)的作用，參與了銀屑病、疣等多種皮膚性疾病的過程，然而，HBD-2在大皰性類天皰瘡中的研究，國內(nèi)外鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化的方法半定量的檢測HBD-2在大皰性類天皰瘡患者皮損組織中的表達(dá)，并對(duì)大皰性類天皰瘡的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象：20例大皰性類天皰瘡患者皮膚活檢標(biāo)本均來自山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院，男9例，女11例，年齡45~65歲，平均55.5歲，病程20 d~5個(gè)月，取20例銀屑病患者作為陽性對(duì)照組，男性12例，女性8例，年齡25~65歲，平均41歲，所有標(biāo)本經(jīng)組織病理確診。正常皮膚組織來自山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院整形手術(shù)切除的外觀正常的皮膚，其中男性5例，女性15例，年齡21~65歲，平均年齡39歲。入選所有病例4個(gè)月內(nèi)未接受糖皮質(zhì)激素治療、免疫抑制治療及其他治療，且排除了感染性疾病及系統(tǒng)性疾病，妊娠期及哺乳期患者未納入本次研究。

1.2 方法

1.2.1 將組織標(biāo)本制成石蠟標(biāo)本，石蠟標(biāo)本切片至4 μm厚，將實(shí)驗(yàn)的切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟至水，高壓鍋抗原修復(fù)45 s，PBS浸洗3次，每次3 min，3% H2O2滅活，PBS 浸洗后，滴加山羊血清37 ℃孵育20 min，滴加一抗（HBD-2的濃度為1∶250）。4 ℃過夜，PBS浸洗3 min 3次，滴加二抗，并進(jìn)行DAB顯色，自來水終止顯色，蘇木精復(fù)染，封片。陰性對(duì)照為滴加PBS液去除假陽性。

1.2.2 免疫組化檢測HBD-2結(jié)果判定：細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為結(jié)果陽性細(xì)胞，不出現(xiàn)即為陰性。每張切片在光學(xué)顯微鏡的400×視野下均選取5個(gè)不重疊的代表部位，用計(jì)算機(jī)圖像分析儀測定平均灰密度值，再用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法取中位數(shù)進(jìn)行結(jié)果比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，用中位數(shù)M表示。計(jì)量資料的組間采用成組秩和檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 表達(dá)部位 HBD-2在大皰性類天皰瘡皮損處、銀屑病皮損處及正常皮膚的表達(dá)部位不同，在大皰性類天皰瘡的基底層、棘層、顆粒層的胞質(zhì)及胞核表達(dá)，呈強(qiáng)陽性；在尋常型銀屑病皮損處基底層、棘層和顆粒層細(xì)胞的胞質(zhì)表達(dá)，在毛囊、皮脂腺、小汗腺及血管壁亦可見表達(dá)；正常皮膚的基底層可見HBD-2的少量表達(dá)甚至陰性表達(dá)。

2.2 表達(dá)強(qiáng)度 HBD-2在大皰性類天皰瘡皮損區(qū)、銀屑病皮損區(qū)及正常皮膚的表達(dá)強(qiáng)度不同，HBD-2在大皰性類天皰瘡皮損區(qū)表達(dá)高于比正常皮膚，甚至高于尋常型銀屑病陽性對(duì)照組，見表1。

表1 三組平均灰度值的比較

3 討 論

大皰性類天皰瘡（bullous pemphigoid，BP）是一種好發(fā)于中老年人的自身免疫性表皮下大皰病。針對(duì)表皮細(xì)胞間物質(zhì)橋粒芯蛋白的自身抗體可以使表皮棘細(xì)胞松解[2]，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)BP患者體內(nèi)存在針對(duì)BP180的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，能自發(fā)識(shí)別BP180。

人類β防御素是防御素家族中的重要分支，人類β防御素家族成員較多，有β-防御素1、2、3、4，β-防御素2（HBD-2）是人類最早從銀屑病患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的β防御素家族成員，呈誘導(dǎo)性性表達(dá)，自發(fā)現(xiàn)以來就備受關(guān)注，研究其甚多，其中HBD-2不僅可通過該變生物膜通透性直接殺滅病原微生物，還可以通過介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞釋放免疫因子調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，在炎性反應(yīng)和創(chuàng)傷修復(fù)過程發(fā)揮著重要作用。

本次實(shí)驗(yàn)中，HBD-2在大皰性類天皰瘡患者皮損處表達(dá)于基底層、棘層、顆粒層的胞質(zhì)及胞核，在皮脂腺、毛囊、血管壁及小汗腺亦可見少量表達(dá)，表明在大皰性類天皰瘡皮損處免疫活動(dòng)活躍，推測大皰性類天皰瘡皮損處不易發(fā)生感染；HBD-2可能參與該病的發(fā)生及發(fā)展，目前關(guān)于HBD-2與大皰性類天皰瘡的研究，國內(nèi)未見報(bào)道，國外有少量報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，正常皮膚基底部有少量HBD-2的表達(dá)，其表達(dá)與皮膚的免疫功能有關(guān)，能夠起到一定抵抗外來微生物的作用。本實(shí)驗(yàn)中HBD-2在銀屑病皮損區(qū)基底層、棘層和顆粒層細(xì)胞的胞質(zhì)表達(dá)，在毛囊、皮脂腺、小汗腺及血管壁亦可見表達(dá)，德國Harder[3]等發(fā)現(xiàn)HBD-2在銀屑病皮損中的表達(dá)，合成和分泌HBD-2的細(xì)胞主要是上皮細(xì)。多種細(xì)胞因子及細(xì)菌病毒產(chǎn)物均可誘導(dǎo)HBD-2的表達(dá)。Hollox等[4]對(duì)銀屑病患者和正常人群的β防御素基因區(qū)域進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)與銀屑患者的HBD-2基因的拷貝數(shù)增多，Ong等[5]研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮膚結(jié)構(gòu)雖然被破壞，但是卻很少發(fā)生感染，其原因之一即為銀屑病患者皮損區(qū)HBD-2表達(dá)較高，Huh[6]等研究了HBD-2在尋常型銀屑病皮損處中的表達(dá)分布情況，發(fā)現(xiàn)HBD-2在尋常型銀屑病患者皮損處主要表達(dá)于基底層、棘層和顆粒層細(xì)胞的胞質(zhì)。

上述結(jié)果表明，大皰性類天皰瘡患者的HBD-2表達(dá)比正常皮膚高，甚至高于尋常型銀屑病患者，HBD-2參與了大皰性類天皰瘡的發(fā)病過程，為大皰性類天皰瘡的治療提供新的思路，同時(shí)也可以為其他自身免疫性疾病的治療提供新的思路，減少了傳統(tǒng)糖皮質(zhì)激素治療帶來的不良反應(yīng)。

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中圖分類號(hào)：R758.66

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-8194（2016）06-0091-02