羅林娜，楊　萍，黃　偉

(四川大學華西第四醫(yī)院重癥監(jiān)護室，四川成都　610041)

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◇中藥醫(yī)研究◇

花青素對大鼠肝缺血再灌注損傷的作用及其機制

羅林娜，楊萍，黃偉

(四川大學華西第四醫(yī)院重癥監(jiān)護室，四川成都610041)

摘要：目的探討花青素對大鼠肝缺血再灌注損傷的作用及其機制。方法30只SD 大鼠隨機分成假手術組、模型組和花青素組。模型組和花青素組采用血管夾閉肝左中葉血管分支90 min再灌注4 h構建肝缺血再灌注模型，花青素組在缺血前90 min腹腔注射花青素(100 mg/kg)，模型組腹腔注射等量生理鹽水。再灌注4 h后處死大鼠，取肝組織和采集血清。ELISA法檢測血清中ALT、AST活性和促炎癥因子白介素-6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量；HE染色觀察肝組織病理形態(tài)學變化；實時定量PCR法測定IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA的水平；硫代巴比妥酸(TBA)法測定丙二醛(MDA)含量；黃嘌呤氧化酶法測定過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)活性；Western blot法測定肝組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3和P53蛋白表達；結(jié)果與假手術組相比，模型組ALT、AST活性增高，血清和肝臟中IL-6、IL-1β、TNF-α分泌量和mRNA表達增高，MDA含量增高，p-JAK2、p-STAT3、P53表達增加，肝臟病理改變明顯，而CAT、GPx和SOD活性明顯降低，JAK2和STAT3表達無明顯變化。與模型組相比，花青素組ALT、AST活性降低，血清和肝臟中IL-6、IL-1β、TNF-α分泌量和mRNA表達降低，MDA含量減少，p-JAK2、p-STAT3、P53表達降低，肝臟病理改變減輕，而CAT、GPx和SOD活性明顯增加，JAK2和STAT3表達依然無明顯變化。結(jié)論花青素可通過抑制氧化應激和炎癥減輕肝臟缺血再灌注損傷，其機制可能與抑制JAK2/STAT3/P53信號通路的激活有關。

關鍵詞：花青素；肝缺血再灌注損傷；炎癥；氧化應激；JAK2/STAT3/P53信號通路

肝缺血再灌注損傷是肝臟供血中斷，重新恢復血供導致肝臟損傷加重的臨床危癥，常好發(fā)于心臟體外大循環(huán)手術、休克、肝臟切除等，損傷重，預后差。其發(fā)病機制復雜，研究表明炎癥和氧化應激在肝缺血再灌注損傷中扮演重要角色[1-2]。既往研究顯示，JAK2/STAT3/P53信號通路可介導炎癥反應和氧化應激[3-4]?；ㄇ嗨?anthocyanin)是一種水溶性的植物色素，既往研究顯示花青素可以減輕心臟、腦缺血再灌注損傷[5-6]，調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號途徑[7]，但其對肝缺血再灌注損傷的作用及其機制尚不清楚。本研究擬用大鼠作為研究對象，探討花青素對肝缺血再灌注損傷的作用及其機制。

1材料與方法

1.1藥物及試劑白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(Ebioscience, USA)；花青素注射液(哈森，中國)；β-actin抗體(Abmart，中國)；JAK2、p-JAK2、p-STAT3、STAT3、P53抗體(CST, USA)；β-actin(Abgent，美國)；MDA、CAT、GPx和SOD試劑盒(Abgent，美國)。紫外分光光度計(Thermo fisher)，逆轉(zhuǎn)錄儀(eppendorf)，qPCR儀(BIO-RAD IQ5)，顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)。

1.2實驗動物的分組和肝缺血再灌注損傷模型的構建SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量220～250 g，購自并飼養(yǎng)于華西醫(yī)院實驗動物中心(使用證明號：012098)。大鼠隨機分為假手術組(n=10)、模型組(n=10)和花青素組(n=40，分為12.5、25、50、100 mL/kg 4個劑量組，每組10只)。模型組和花青素組按文獻[8]建立肝臟缺血再灌注模型。花青素組于術前1 h分別給予不同劑量的花青素腹腔注射[8]，假手術組和模型組術前給予腹腔注射等量生理鹽水；于肝臟恢復血流再灌注后4 h處死大鼠，取肝臟和收集血清。

1.3ELISA檢測血清中ALT、AST、IL-6、TNF-α和IL-1水平按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中ALT、AST、IL-6、TNF-α和IL-1水平。

1.4肝臟病理觀察肝臟組織采用100 mL/L中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水浸蠟(Thermo Fisher)，石蠟包埋，4 μm切片，脫蠟透明后行HE染色。病理評分標準[9]：0分，沒有損傷；1分，肝臟病理表現(xiàn)為輕微損傷，胞質(zhì)空泡變性和局灶性細胞核固縮；2分，中度至重度損傷，肝臟病理表現(xiàn)為具有廣泛的核固縮；3分，肝臟病理表現(xiàn)為肝臟廣泛的出血和中性粒細胞浸潤解體，乃至嚴重壞死。

1.5實時定量PCR檢測肝臟IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達取各組肝臟組織50 mg，置入1.5 mL EP管中，利用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量。采用TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行實時定量PCR反應。PCR以β-actin為內(nèi)參，具體方法參考文獻[4]。所用特異性引物為TNF-α：F 5′-GCCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3′，R 5′-

GAAGGCAGCCCTGGTAACC-3′；IL-1β：F 5′-TC-

TCGCCCAGGGAGTGCAAAGAGAG-3′，R 5′-TC-TCGCCCAGGGAACATCTCGAAGCG-3′；IL-6：F 5′-

CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3′，R 5′-AGTG-GTATAGACAGGTCTGTTGG-3′；β-actin：F 5′-AGA-

GGGAAATCGTGCGTGAC-3′，R 5′-CAATAGTG-

ATGACCTGGCCGT-3′。SYBR實時定量PCR法檢測TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA相對表達基于比較Ct(threshold cycle)值法，每個樣本的mRNA含量用各內(nèi)參β-actin含量進行標準化，用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.6MDA的含量和CAT、GPx和SOD活性測定取各組肝臟組織50 mg制備勻漿，硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA的含量，黃嘌呤氧化酶法測定CAT、GPx和SOD的活性。

1.7JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3和P53蛋白表達測定各組取50 mg肝臟組織，利用Western blot方法檢測各組JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3和P53蛋白表達水平，具體方法參考文獻[9]。

2結(jié)果

2.1花青素減輕肝臟缺血再灌注損傷與假手術組相比，模型組ALT和AST活性升高(P=0.003 12、0.043 77)，差異具有統(tǒng)計學意義。花青素組與模型組相比，ALT和AST活性降低(P=0.034 4、0.041；0.021 7、0.018 9；0.037 8、0.025 3；0.012 8、0.045 1)，差異具有統(tǒng)計學意義(表1)。表明花青素預處理可以濃度依賴性地減輕肝臟缺血再灌注損傷，其最佳濃度為100 mL/kg。

2.2花青素對血清IL-6、TNF-α 和 IL-1β分泌的影響與假手術組比較，模型組血清中IL-6、TNF-α和IL-1β分泌增加(P=0.000 4，0.000 3，0.000 7)，差異具有統(tǒng)計學意義。而花青素組(100 mL/kg)與模型組相比，IL-6、TNF-α和IL-1β分泌明顯減少(P=0.045 2，0.023 7，0.039 3)，差異具有統(tǒng)計學意義(圖1)。

表1花青素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后ALT和AST活性的影響

Tab.1The effect of anthocyanin pretreatment on the activities of ALT and AST

組別例數(shù)ALT(U/L)AST(U/L)假手術組1017±39±2模型組10128±12*97±5*花青素組 12.5mL/kg1070±7#62±4# 25mL/kg1055±5#52±3# 50mL/kg1039±3#43±2# 100mL/kg1036±4#39±4#

與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

圖1花青素預處理對血清中IL-6、TNF-α、IL-1β分泌的影響

Fig.1 The effect of anthocyanin pretreatment on the secretion of IL-6, TNF-α and IL-1β in serum detected by ELISA

與假手術組比較，**P<0.001；與模型組比較，#P<0.05。

2.3花青素減輕肝臟缺血再灌注損傷后肝臟病理改變假手術組肝細胞形態(tài)正常，肝血竇區(qū)無充血、腫脹，未見炎性細胞浸潤(圖2A)，其損傷評分為(0.3±0.2)分。模型組肝小葉結(jié)構大量破壞，肝細胞廣泛聚集、壞死，肝血竇區(qū)明顯充血腫脹，門管區(qū)有大量炎性細胞浸潤(圖2B)，其損傷評分為(3.5±0.5)分，與假手術組相比損傷加重(P=0.000 5)?；ㄇ嗨亟M(100 mL/kg)肝小葉破壞，肝細胞聚集、壞死，肝血竇區(qū)充血腫脹, 門管區(qū)炎性細胞浸潤明顯減少(圖2C)，其損傷評分為(1.0±0.5)分，與模型組相比損傷減輕(P=0.003 6)。

2.4花青素對肝組織IL-6、TNF-α和IL-1β mRNA表達的影響與假手術組比較，模型組肝組織IL-6、TNF-α和IL-1β mRNA表達增加(P=0.000 2，0.000 6，0.000 5)，差異具有統(tǒng)計學意義。而花青素組(100 mL/kg)與模型組相比，IL-6、TNF-α和IL-1β mRNA表達減少(P=0.031 5，0.045 2，0.019 7)，差異具有統(tǒng)計學意義(圖3)。

圖2HE染色觀察花青素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后肝臟病理改變的影響

Fig.2 The effect of anthocyanin pretreatment on the changes of hepatic histology (HE, ×200)

A：假手術組；B：模型組；C：花青素組(100 mL/kg)。

圖3RT-PCR檢測花青素預處理對肝組織IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表達的影響

Fig.3 The effect of anthocyanin pretreatment on the mRNA levels of IL-6, TNF-α and IL-1β detected by RT-PCR

與假手術組比較，**P<0.001；與模型組比較，#P<0.05。

2.5花青素對肝組織MDA含量和CAT、GPx 、SOD活性的影響與假手術組相比，模型組MDA含量明顯增高(P=0.000 12)，而CAT、GPx和SOD活性降低(P=0.000 3，0.000 7，0.000 9)，差異具有統(tǒng)計學意義；花青素組(100 mL/kg)與模型組相比，MDA含量降低(P=0.046)，而CAT、GPx和SOD活性增高(P=0.004 3，0.000 6，0.002 4)，差異具有統(tǒng)計學意義(表2)。表明花青素預處理可以明顯減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成、增強抗氧化應激酶的活性。

表2花青素對MDA含量以及CAT、GPx 和SOD活性的影響

Tab.2The effect of anthocyanin on the content of MDA and the activities of CAT, GPx and SOD

組別例數(shù)MDA(pg/mL)CAT(pg/mL)GPX(pg/mL)SOD(pg/mL)假手術組10150±50100±15100±20110±10模型組102200±400**40±5**30±5**45±10**花青素組101100±250#75±10##55±10#65±10#

與假手術組比較，**P<0.001；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.6花青素對JAK2/STAT3信號通路的影響與假手術組相比，模型組p-JAK2和p-STAT3表達增加(P=0.000 2，0.000 5)，差異具有統(tǒng)計學意義，而JAK2和STAT3表達無差異(P=0.053 3，0.061 2)?；ㄇ嗨亟M(100 mL/kg)與模型組相比，p-JAK2和p-STAT3表達降低(P=0.002 3，0.003 6)，差異具有統(tǒng)計學意義，JAK2和STAT3表達無差異(P=0.067 3，0.058 1，圖4)。提示肝臟缺血再灌注損傷后JAK2/STAT3信號通路明顯激活，花青素預處理可抑制JAK2/STAT3信號通路的激活。

2.7花青素對P53信號通路的影響與假手術組相比，模型組P53表達增加(P=0.000 4)，差異具有統(tǒng)計學意義；而花青素組(100 mL/kg)與模型組相比，P53表達減少(P=0.036 8)，差異具有統(tǒng)計學意義(圖5)。提示肝臟缺血再灌注損傷后JAK2/STAT3介導P53信號通路的激活，花青素預處理可抑制該信號通路的激活。

3討論

肝臟疾病是危害我國人民健康的重大疾病之一，其長病程、難治性以及相對不良的預后，對患者的生存質(zhì)量造成極大的影響。肝臟缺血再灌注損傷是肝臟手術、肝移植或休克等常見并發(fā)癥，其誘發(fā)的免疫反應以及釋放的免疫因子會導致患者肝臟以及肺、腸等遠隔臟器功能的損傷，影響術后各器官功能的恢復，最終增加患者的圍手術期死亡風險[1-2]。因此，如何能夠減輕移植肝臟的缺血再灌注損傷成為臨床研究熱點之一。最近研究表明，肝臟缺血可導致機體細胞缺氧，從而機體ATP合成減少，引發(fā)氧化應激和炎癥反應的激活，肝臟恢復血流灌注后，炎癥反應和氧化應激進一步加劇，誘發(fā)大量肝細胞壞死，進而加劇肝臟損傷[1-2]。因此，削弱炎癥反應和氧化應激是減輕肝臟缺血再灌注損傷的有效治療途徑之一。

圖4Western blot檢測花青素對JAK2、p-JAK2、p-STAT3和STAT3表達的影響

Fig.4 The effect of anthocyanin pretreatment on the expressions of JAK2, p-JAK2, p-STAT3 and STAT3 detected by Western blot

與假手術組比較，**P<0.001；與模型組比較，#P<0.05。

圖5Western blot檢測花青素對P53表達的影響

Fig.5 The effect of anthocyanin pretreatment on the expression of P53 examined by Western blot

與假手術組比較，**P<0.001；與模型組比較，#P<0.05。

花青素又名花色素，是廣泛存在于自然界植物中的水溶性天然色素，屬于黃酮類化合物。最近研究發(fā)現(xiàn)花青素具有抗炎、抗氧化應激[10]和增強免疫力的作用。而炎癥和氧化應激是肝臟缺血再灌注損傷的重要致病機制。

本實驗結(jié)果顯示，花青素預處理可以明顯減輕肝臟缺血再灌注損傷后肝功能損害和肝臟組織結(jié)構的病理改變。經(jīng)花青素預處理后促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達和分泌減少，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量減少，而抗氧化應激酶CAT、GPx和SOD活性增加。提示花青素預處理可通過抑制炎癥反應和氧化應激減輕肝臟缺血再灌注損傷。JAK2/STAT3/P53信號途徑是一經(jīng)典細胞信號通路，可介導細胞生長、凋亡、分化、代謝等[11-13]。最近研究發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3/P53信號通路激活可調(diào)節(jié)炎癥反應和氧化應激[11-13]。研究表明花青素可調(diào)節(jié)JAK2/STAT3[7]。本實驗結(jié)果顯示，花青素預處理可減少p-JAK2、p-STAT3和P53的表達，但對JAK2和STAT3表達無明顯影響。因此，我們推測花青素可通過抑制JAK2/STAT3/P53信號通路的激活抑制炎癥反應和氧化應激，減輕肝臟缺血再灌注損傷。但花青素是否還通過其他信號通路減輕肝臟缺血再灌注損傷，尚需進一步研究證實。

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(編輯邱芬)

收稿日期：2015-10-27修回日期：2016-2-29

通訊作者：羅林娜. E-mail: 740297088@qq.com

中圖分類號：R575.3

文獻標志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604026

The effect and mechanism of anthocyanin on hepatic ischemia reperfusion injury in rats

LUO Lin-na, YANG Ping, HUANG Wei

(Department of Intensive Care Unit, West China Fourth Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of anthocyanin on hepatic ischemia reperfusion injury in rats. MethodsTotally 30 SD rats were randomly divided into sham group, model group and anthocyanin group (n=10 in each). Hepatic ischemia was constructed in model group and anthocyanin group by ligating left middle lobe of liver vascular branches for 90 min. Anthocyanin was administered at 90 min before ischemia by intraperitoneal injection at the concentration of 100 mg/kg for rats in anthocyanin group. Rats in model group and sham group were injected with the same dosage of normal saline at the same time. Serum and liver tissues were collected at 4 h after reperfusion by putting the rats to death. The expressions of ALT, AST, IL-6, IL-1β and TNF-α in the serum were examined by ELISA. The pathological changes of liver tissue were evaluated by HE. The mRNA levels of IL-6, IL-1β and TNF-α were measured by RT-PCR. The content of MDA was examined by TBA. The activities of CAT, GPx and SOD were evaluated by xanthine oxidase method and the expression of p-JAK2, p-STAT3, JAK2, STAT3 and P53 were measured by Western blot. ResultsCompared with those in the sham group, the activities of ALT and AST, the expressions of p-JAK2, p-STAT3, P53, IL-6, IL-1β, TNF-α and the content of MDA as well as the pathological changes of the liver in model group were significantly increased. However, the activities of CAT, GPx and SOD in model group were decreased and the expressions of JAK2 and STAT3 between the two groups did not differ. Compared with those in model group, the activities of ALT and AST,the expressions of p-JAK2, p-STAT3, P53, IL-6, IL-1β, TNF-α, the content of MDA and the pathological changes of the liver in anthocyanin group were significantly decreased. But the activities of CAT, GPx and SOD in anthocyanin group were increased and the expressions of JAK2 and STAT3 between the two groups did not differ, either. ConclusionAnthocyanin pretreatment can significantly decrease hepatic ischemia/reperfusion injury by suppressing oxidative stress and inflammation, and the mechanism may be associated with reducing JAK2/STAT3/P53 signaling activation.

KEY WORDS:anthocyanin; hepatic ischemia-reperfusion injury; inflammation; oxidative stress; JAK2/STAT3/P53 signaling

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160613.1630.002.html(2016-06-13)