張　平

(天津市第五中心醫(yī)院血液腫瘤內(nèi)科，天津　300450)

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◇經(jīng)驗交流◇

microRNA-451在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者血漿中的表達(dá)及意義

張平

(天津市第五中心醫(yī)院血液腫瘤內(nèi)科，天津300450)

摘要：目的探討microRNA-451(miR-451)在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B lymphoma, DLBCL)患者血漿中的表達(dá)水平及其臨床意義。方法利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)方法檢測27例DLBCL患者和27例健康體檢者血漿中miR-451的表達(dá)水平，并統(tǒng)計分析DLBCL患者血漿中miR-451表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果miR-451在DLBCL患者血漿中表達(dá)水平明顯低于正常對照組[(0.41±0.15)vs.(0.64±0.21)]，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；DLBCL患者血漿中miR-451表達(dá)水平在不同性別、年齡、血清LDH水平及原發(fā)部位之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而與Ann Arbor分期及IPI評分明顯相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論DLBCL患者血漿中miR-451表達(dá)水平降低，可能參與了DLBCL的病理過程。

關(guān)鍵詞：彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤；microRNA-451；定量PCR

淋巴瘤(lymphoma)是免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤，起源于淋巴結(jié)和淋巴組織，其發(fā)生大多與免疫應(yīng)答過程中淋巴細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生的某種免疫細(xì)胞惡變有關(guān)。按組織病理學(xué)改變，淋巴瘤可分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)兩大類。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B lymphoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常見的一種類型，約占35%～40%。淋巴瘤是最早發(fā)現(xiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一。我國淋巴瘤的總發(fā)病率男性為1.39/10萬，女性為0.84/10萬，死亡率為1.5/10萬。一般認(rèn)為感染及免疫因素起重要作用，理化因素及遺傳因素等也有不可忽視的作用，病毒學(xué)說頗受重視。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類長度約為18～25 nt保守的單鏈非編碼RNA，主要通過與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)域(3′-untranslated region, 3′-UTR)結(jié)合進而抑制該基因的表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用。目前普遍認(rèn)為miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]，多項研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在淋巴瘤的發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用[3-6]。miR-451是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，研究表明miR-451在多種實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)異常[7-13]，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-451在間變性大細(xì)胞淋巴瘤[14]、濾泡性淋巴瘤[15]中表達(dá)異常。目前，miR-451在DLBCL中的研究甚少，為了進一步研究miR-451在DLBCL發(fā)病中的作用，我們利用定量PCR方法檢測了DLBCL患者血漿中miR-451的表達(dá)水平，并分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1研究對象選取2014年1月至2015年9月在我院血液內(nèi)科住院治療的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中國彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷與治療指南(2013年版)[16]的DLBCL患者27例，其中男性17例，女性10例，年齡21～73歲，中位年齡61歲，所有病例均經(jīng)過術(shù)后病理證實為DLBCL。排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)或繼發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤和血管內(nèi)大B細(xì)胞淋巴瘤、合并其他腫瘤性疾病、嚴(yán)重的感染、合并自身免疫性疾病等。選擇同期27例健康體檢者作為正常對照組，其中男性16例，女性11例，年齡18～70歲，中位年齡59歲，兩組研究對象之間性別、年齡的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，本項研究得到醫(yī)院倫理委員會同意并取得研究對象的知情同意。

1.2方法

1.2.1樣本采集無菌采集所有研究對象的靜脈血5.0 mL，置入EDTA抗凝管中，所有DLBCL患者在抗腫瘤治療前進行采集血樣，分別室溫下2 500 r/min離心10 min、4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后收集上清至無RNA酶的EP管中，-80 ℃保存。

1.2.2定量PCR檢測血漿中miR-451表達(dá)水平血漿中總RNA提取采用mirVanaTMmiRNA分離試劑盒(美國Ambion公司)，嚴(yán)格按照試劑盒說明進行操作。提取的RNA溶于20 μL EDPC處理的水中，利用紫外分光光度儀(美國基因有限公司)檢測A260、A280值，計算RNA濃度和純度，A260/A280比值在1.8～2.1的RNA樣本用于后續(xù)實驗。根據(jù)文獻[17]合成miR-451逆轉(zhuǎn)錄引物及PCR引物。miR-451逆轉(zhuǎn)錄引物序列：TCAACTGGTGTCGT-GGAGTCGGCAATTCAGTTGAAACTCAGT，PCR上

游引物序列：AAACCGTTACCATTACTGAG，下游引物序列：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG。使用miScript Reverse Transcription試劑盒(美國Ambion公司)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第一鏈，合成的cDNA -20 ℃保存。利用SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(德國Qiagen公司)進行定量PCR擴增(美國Bio-Rad公司)，PCR反應(yīng)體系為：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ10 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、3.0 μL模板和5.0 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 5 s、61 ℃ 40 s共35個循環(huán)，每個樣本做三個復(fù)孔，PCR擴增結(jié)束后得到循環(huán)閾值(Ct值)，miR-451的表達(dá)水平采用2-△△Ct進行分析。

2結(jié)果

2.1DLBCL患者與正常對照組血漿中miR-451表達(dá)水平的比較定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-451在DLBCL患者血漿中表達(dá)水平明顯低于正常對照組[(0.41±0.15)vs.(0.64±0.21)]，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.631，P<0.01)。

2.2miR-451表達(dá)水平與DLBCL臨床病理參數(shù)的關(guān)系為了進一步探討miR-451與DLBCL之間的關(guān)系，我們統(tǒng)計分析了miR-451表達(dá)水平與DLBCL臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示DLBCL患者血漿中miR-451表達(dá)水平在不同性別、年齡、血清LDH水平及原發(fā)部位之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而Ⅲ/Ⅳ期DLBCL患者血漿中miR-451水平明顯低于Ⅰ/Ⅱ期患者，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，IPI評分3～5分的DLBCL患者血漿中miR-451水平明顯低于0～2分的患者，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

3討論

非霍奇金淋巴瘤是一組具有不同的組織學(xué)特點和起病部位的淋巴瘤，易發(fā)生早期遠(yuǎn)處擴散。DLBCL是非霍奇金淋巴瘤的一種，主要分為非特指型、可確定的亞型和其他B細(xì)胞型三大類。多數(shù)為原發(fā)DLBCL，也可以由惰性淋巴瘤進展或轉(zhuǎn)化而來，經(jīng)過以蒽環(huán)類藥物為基礎(chǔ)的化療，有超過70%的DLBCL獲得緩解，但最終只有50%～60%的患者獲得長期無病生存[18]。近年來應(yīng)用新的藥物，如抗CD20單克隆抗體，或?qū)︻A(yù)后不良的患者給予強化療，明顯改善了這類患者的預(yù)后。miRNA通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與了細(xì)胞增殖、凋亡和分化過程，目前大量研究表明多種miRNA在實體腫瘤中表達(dá)異常可以作為原癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)病過程[2]，隨著研究不斷深入，miRNA在血液系統(tǒng)腫瘤中的作用越來越受到重視，多項研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在淋巴瘤的表達(dá)異常，參與了淋巴瘤的發(fā)病過程[3-6]。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-34、miR-125a、miR-125b及miR-155等與DLBCL的發(fā)病過程有關(guān)，而外周血中miR-21、miR-155、miR-210、miR-221等表達(dá)水平與DLBCL的診斷、治療及預(yù)后密切相關(guān)[19-24]。

表1DLBCL患者血漿中miR-451水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Tab.1Relationship between the plasma level of miR-451 and clinicopathological characteristics in the patients with DLBCL

參數(shù)例數(shù)miR-451(x±s)t值P值性別0.5020.619 女100.39±0.13 男170.42±0.16年齡0.9490.351 ≥60歲80.37±0.12 <60歲190.43±0.16血清LDH1.5430.135 正常160.45±0.17 升高110.36±0.11原發(fā)部位0.8680.393 淋巴結(jié)內(nèi)180.43±0.15 淋巴結(jié)外90.38±0.12AnnArbor分期2.9790.006 Ⅰ+Ⅱ150.49±0.18 Ⅲ+Ⅳ120.32±0.09IPI評分3.7140.001 0～2分130.52±0.19 3～5分140.31±0.09

miR-451是2005年由ALTUVIA等在人腦垂體RNA中發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，定位于人染色體19q11.2，研究表明miR-451在胃癌、膀胱癌、鼻咽癌等實體瘤組織中表達(dá)降低[7-12]。LOPOTOVA等[13]研究也發(fā)現(xiàn)miR-451在慢性髓細(xì)胞白血病患者體內(nèi)低表達(dá)，miR-451與BCR-ABL的表達(dá)相互抑制，參與了慢性髓細(xì)胞白血病的發(fā)病。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)兒童急性前B淋巴細(xì)胞白血病中miR-451的表達(dá)水平明顯低于正常對照組，提示miR-451在急性前B淋巴細(xì)胞白血病中可能發(fā)揮了一定作用[25]。研究證實miRNA由于長度較短且具有較強的抵抗RNA酶的降解，可以在血液中穩(wěn)定存在[26]。有研究顯示DLBCL患者血清中miR-15a，miR-16-1，miR-29c和miR-155水平比正常人明顯升高，而血清中miR-34a水平降低，提示血清中miRNA可作為DLBCL潛在的診斷指標(biāo)[27]。LIU等[14]研究發(fā)現(xiàn)在間變性大細(xì)胞淋巴瘤組織中miR-451表達(dá)降低，國外學(xué)者利用實時定量PCR方法發(fā)現(xiàn)在濾泡性淋巴瘤患者骨髓中miR-451水平降低[15]。目前，有關(guān)miR-451與DLBCL的研究甚少，為了進一步研究miR-451在DLBCL發(fā)病中的作用，本研究利用定量PCR檢測了DLBCL患者血漿中miR-451的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-451在DLBCL患者血漿中表達(dá)水平明顯低于正常對照組，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。這與miR-451在間變性大細(xì)胞淋巴瘤[14]、濾泡性淋巴瘤[15]中的研究結(jié)果基本一致，提示miR-451參與了DLBCL的發(fā)病過程。同時，本研究還統(tǒng)計分析了miR-451與DLBCL臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示在不同性別、年齡、血清LDH水平及原發(fā)部位之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而與Ann Arbor分期及IPI評分明顯相關(guān)(P<0.05)，提示miR-451可能有助于DLBCL的分期及判斷預(yù)后。

綜上所述，DLBCL患者血漿中miR-451表達(dá)水平降低，與Ann Arbor分期及IPI評分相關(guān)，提示miR-451參與了DLBCL的發(fā)生發(fā)展過程，有可能成為腫瘤分期及預(yù)后判斷的潛在指標(biāo)。但是，miR-451在DLBCL中的具體作用機制尚不清楚。隨著對miR-451與DLBCL研究的不斷深入，可能為DLBCL的早期診斷、預(yù)后及治療提供新的靶點。

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(編輯韓維棟)

收稿日期：2015-12-02修回日期：2015-12-28

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81471175)

通訊作者：張平. E-mail: zphcgd@163.com

中圖分類號：R733.4

文獻標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604029

Expression levels and clinical significance of microRNA-451 in the plasma of patients with diffuse large B lymphoma

ZHANG Ping

(Department of Internal Medicine, Hematology and Oncology of Tianjin Fifth Central Hospital, Tianjin 300450, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression level and clinical significance of microRNA-451 (miR-451) in the plasma of patients with diffuse large B lymphoma (DLBCL). MethodsWe enrolled 27 patients with DLBCL and 27 healthy controls for the study. The plasma level of miR-451 was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Then we analyzed the relationship between the plasma level of miR-451 and pathological characteristics of DLBCL. ResultsThe plasma level of miR-451 in the patients with DLBCL was significantly lower than in healthy controls [(0.41±0.15) vs. (0.64±0.21)] (P<0.01). However, the plasma level of miR-451 was not significantly correlated with the patients’ gender, age, serum LDH level or primary site (P>0.05), but with Ann Arbor tumor stage and IPI score (P<0.05). ConclusionThe plasma level of miR-451 decreases in patients with DLBCL, which indicates that miR-451 may participate in the pathology of DLBCL.

KEY WORDS:diffuse large B lymphoma; microRNA-451; RT-PCR

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81471175)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.1633.016.html(2016-06-08)