張　悅，符喬珊，劉　韡，高　慶

(1. 西安市第四人民醫(yī)院婦產科，陜西西安　710004；2. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院婦產科，陜西西安　710004)

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◇中醫(yī)藥研究◇

黃芩苷對宮頸癌HeLa細胞侵襲轉移的抑制作用及其機制

張悅1，符喬珊1，劉韡2，高慶2

(1. 西安市第四人民醫(yī)院婦產科，陜西西安710004；2. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院婦產科，陜西西安710004)

摘要：目的觀察黃芩苷對宮頸癌HeLa細胞侵襲轉移的作用及其相應機制。方法利用MTT法檢測黃芩苷對HeLa細胞增殖的影響；Transwell小室法檢測黃芩苷對HeLa細胞侵襲能力的影響；Real-time PCR法檢測黃芩苷對MMP-2、MMP-9 RNA表達水平的影響；Western blot法檢測黃芩苷對MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響；Western blot法檢測黃芩苷對P38和p-P38蛋白表達的影響；Real-time PCR法檢測黃芩苷和sb203580聯合應用對MMP-2和MMP-9 RNA表達水平的影響。結果黃芩苷能夠有效抑制HeLa細胞的增值，當質量濃度超過60 μg/mL時，與對照組相比(0 μg/mL)差異出現統(tǒng)計學意義。在低于細胞增殖抑制濃度時，黃芩苷也能夠有效抑制HeLa細胞的侵襲，10、20、40 μg/mL組穿過基質膠到達小室底端的細胞數目分別為對照組的(97.58±17.78)%、(67.95±49.75)%和(32.35±20.41)%。黃芩苷能夠有效抑制HeLa細胞中MMP-2和MMP-9的表達及有效抑制HeLa細胞中P38的磷酸化水平；P38信號通路抑制劑預處理，能夠增強黃芩苷對MMP-2和MMP-9表達的抑制作用。結論黃芩苷能夠有效抑制HeLa細胞的侵襲轉移，這種作用可能與其通過調節(jié)P38信號通路的活性進一步調節(jié)MMP-2和MMP-9的表達有關。

關鍵詞：黃芩苷；HeLa細胞；侵襲；P38信號通路；基質金屬蛋白酶

宮頸癌是最為常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于婦科惡性腫瘤的第2位。近年來35歲以下年輕女性中宮頸癌的發(fā)病率逐年上升，這與HPV感染率的增高相關。宮頸癌的常規(guī)治療包括手術治療、放療、化療和綜合治療，這些治療在取得一定療效的同時會帶來較多的副作用和并發(fā)癥。黃芩苷是從中藥黃芩中提取的一種單體化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫活化和抗病毒等多種功能[1-2]。新近的研究發(fā)現，黃芩苷在體內外均有廣泛的抗腫瘤作用，且在發(fā)揮這種抗腫瘤作用時對正常細胞沒有明顯毒性[2]。研究發(fā)現，黃芩苷對包括結腸癌、乳腺癌、肺癌和淋巴瘤在內的多種腫瘤中具有明確的抗腫瘤作用[3-6]。但關于黃芩素對宮頸癌細胞侵襲轉移作用的報道較少?；谝陨?，本研究擬探討黃芩素對宮頸癌細胞侵襲轉移的作用及其可能機制。

1材料與方法

1.1主要試劑黃芩苷購于美國Sigma公司；Transwell小室購于美國Corning公司；MTT細胞增殖及活性檢測試劑、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、DMSO、Trypsin-EDTA溶液、蛋白分子量標記、細胞裂解液、HRP標記的羊抗兔IgG(H+L)抗體和PVDF膜購于碧云天公司；兔抗人MMP-2、MMP-9，P38和p-P38購于Cellsignal公司；GAPDH購于Santa Crus公司。

1.2細胞培養(yǎng)HeLa細胞為本實驗室保有。細胞培養(yǎng)液為含有100 mL/L血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素。細胞在37 ℃、50 mL/L CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，細胞融合率達到70%～80%時進行傳代培養(yǎng)。

1.3黃芩苷溶液的配制利用100% DMSO配制黃芩苷母液，原液質量濃度為60 mg/mL，儲存溫度為4 ℃。所有實驗中用藥均采用DMEM培養(yǎng)基現用現配的方法，所有培養(yǎng)液中DMSO的終質量濃度均小于1 g/L。

1.4MTT法檢測黃芩苷對HeLa細胞增殖的影響取對數生長期的HeLa細胞，配成密度為5×104/mL懸液接種于96孔板中，每孔接種量為100 μL。細胞貼壁培養(yǎng)6 h后，利用含有黃芩苷藥物的溶液培養(yǎng)細胞24 h，藥物質量濃度為0、10、20、40、60、80、100 μg/mL，其中0 μg/mL組為對照組。其后96孔板中每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，置于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)4 h。在加入DMSO后于酶標儀中選取570 nm進行吸光度(A)讀數。每組實驗均獨立重復3次。

抑制率(IR)(%)=(1-治療組A/對照組A)×100%。

1.5細胞侵襲實驗取對數生長期HeLa細胞，胰酶常規(guī)消化后利用含20 mL/L血清的培養(yǎng)基制成5×105/mL細胞懸液，在Tranwell小室上室中加入含有不同濃度黃芩素的細胞懸液0.4 mL，下室中加入血清濃度為100 mL/L的常規(guī)培養(yǎng)基。24 h后取出小室對細胞進行固定，用棉簽去除上室中殘留細胞并對小室底部的細胞進行固定、染色和拍照，并在顯微鏡下進行計數(每個濃度組隨機選擇5個視野)。

1.6Real-time PCR檢測黃芩苷對MMP-2和MMP-9轉錄水平的影響Trizol法提取各組細胞總RNA，根據TaKaRa公司PrimeScript RT-PCR Kit試劑說明書進行反轉錄cDNA。以cDNA為模板進行Real-time PCR反應并對結果進行分析，引物設計見表1。每組實驗均獨立重復3次。

表1Real-time PCR 引物序列

Tab.1Gene-specific primer pairs used for Real-time PCR

基因序列β-actinCCATCGTCCACCGCAAAT(forward)CATGCCAATCTCATCTTGTTT(reverse)MMP-2CTCATCGCAGATGCCTGGAA(forwardTTCAGGTAATAGGCACCCTTGAAGA(reverse)MMP-9GTCCACCCTTGTGCTCTTCC(forward)GCCACCCGAGTGTAACCAT(reverse)

1.7Western blot檢測黃芩苷對侵襲轉移相關蛋白的影響黃芩苷處理HeLa細胞24 h后，細胞常規(guī)消化，冰PBS洗滌2次，然后加入裂解液進行裂解。利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，并根據蛋白提取物濃度確定上樣量。SDS凝膠中每孔加入等量蛋白，根據不同分子量的目的蛋白調整電泳時間和電壓，其后轉膜。轉膜結束后，在50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h。然后將膜封閉于含有各種抗體的溶液中，4 ℃ 搖床過夜。第2天PBST洗滌3次，每次15 min。然后常溫封閉相應二抗1 h。再次用PBST洗滌3次，最后一次用PBS洗滌，時間均為15 min。每組實驗均重復3次，最后利用成像系統(tǒng)對結果圖像進行采集，并對數據進行分析。

2結果

2.1黃芩苷對HeLa細胞增殖的影響本研究發(fā)現黃芩苷能夠明顯抑制HeLa細胞的增殖，隨著黃芩苷濃度的升高，其對HeLa細胞增殖的抑制作用逐漸增強，與對照組相比，當濃度達到60 μg/mL時出現統(tǒng)計學差異(P<0.01，圖1)。

圖1黃芩苷對HeLa細胞增殖的抑制作用Fig.1 The inhibition of baicalin on the proliferation of HeLa cells

與0 μg/mL組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2黃芩苷對HeLa細胞侵襲能力的影響本研究前期實驗結果顯示，黃芩苷在濃度高于60 μg/mL時，能夠明顯抑制HeLa細胞的增殖。為此我們選擇低于60 μg/mL濃度的黃芩苷作為檢測其抗侵襲能力的實驗濃度，以消除其抗增殖能力對實驗結果的影響。結果顯示，在低于細胞毒性濃度的情況下，黃芩苷能夠明顯抑制HeLa細胞的侵襲，10、20、40 μg/mL濃度組細胞穿過基質膠到達小室底端的細胞數目，分別為對照組的(97.58±17.78)%、(67.95±49.75)%和(32.35±20.41)%，這種抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強，差異具有統(tǒng)計學意義(圖2)。

圖2黃芩苷對HeLa細胞侵襲轉移能力的影響

Fig.2 The inhibitory effect of baicalin on the invasion of HeLa cells

A：不同濃度組穿過基質膠到達小室低端的細胞(紫色)；B：對小室底端細胞進行計數后的統(tǒng)計結果。與0 μg/mL組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3黃芩苷對MMP-2和MMP-9 RNA轉錄水平的影響為了進一步檢測黃芩苷抑制HeLa細胞侵襲轉移的機制，我們利用Real-time PCR技術檢測了黃芩苷對MMP-2和MMP-9 RNA轉錄水平的影響。結果發(fā)現，黃芩苷能夠在RNA水平明顯抑制MMP-2和MMP-9的轉錄，10、20、40 μg/mL濃度組MMP-2為對照組的(72.32±0.49)%、(58.70±11.42)%和(48.12±4.24)%，MMP-9為對照組的(74.37±10.18)%、(62.50±15.89)%和(39.54±6.18)%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

2.4黃芩苷對MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響同2.3項，我們檢測了黃芩苷對HeLa細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響。結果發(fā)現，黃芩苷能夠明顯抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達，對照組和黃芩苷治療組MMP-2和MMP-9的相對表達量分別為0.73±0.1和0.52±0.06，0.95±0.1和0.64±0.07，差異具有統(tǒng)計學意義(圖4)。

圖3黃芩苷對HeLa細胞中MMP-2和MMP-9轉錄水平的影響

Fig.3 The effect of baicalin on the transcription of MMP-2 and MMP-9 in HeLa cells at the mRNA level

與0 μg/mL組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖4黃芩苷對MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響

Fig.4 The effect of baicalin on the expressions of MMP-2 and MMP-9 in HeLa cells at the protein level

A：各組細胞MMP-2、MMP-9和GADPH的蛋白表達情況；B：對各蛋白表達的灰度值進行統(tǒng)計后的結果。與0 μg/mL組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.5黃芩苷對P38磷酸化水平的影響為了進一步探討黃芩苷抑制HeLa細胞侵襲轉移的可能調控機制，檢測了黃芩苷對P38信號通路活性的影響。結果發(fā)現，黃芩苷能夠明顯抑制P38信號通路的活性。隨著黃芩苷濃度的升高P38的磷酸化水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(圖5)。而黃芩苷與P38信號通路抑制劑聯合應用后，sb203580組、sb203580+黃芩素和黃芩苷組MMP-2為對照組的(88.08±5.39)%、(51.85±11.36)%和(67.03±7.23)%，MMP-9為對照組的(84.09±21.58)%、(44.90±3.25)%和(55.47±12.07)%(圖6)。

圖5黃芩苷對P38信號通路活性的影響

Fig.5 The effect of baicalin on the activity of P38 signal pathway

A：各組細胞中P38和p-P38蛋白的表達情況；B：對各個蛋白的灰度值進行統(tǒng)計后的結果。與0 μg/mL組比較，**P<0.01。

圖6黃芩苷與sb203580聯合應用對MMP-2和MMP-9表達的影響

Fig.6 The effect of baicalin and sb203580 on the expressions of MMP-2 and MMP-9

與0 μg/mL組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3討論

宮頸癌是最為常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于婦科惡性腫瘤的第2位。隨著HPV的感染率增高宮頸癌呈現出年輕化的趨勢，表現為35歲以下年輕女性中宮頸癌的發(fā)病率逐年上升[7]。宮頸癌的常規(guī)治療包括手術治療、放療治療、化學治療和綜合治療。但對于晚期宮頸癌患者，這些治療在取得一定療效的同時會帶來較多的副作用和并發(fā)癥。黃芩苷是從中藥黃芩中提取的一種單體化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫活化和抗病毒等多種功能[1]。新近的研究發(fā)現，黃芩苷能在對正常細胞無明顯毒性的情況下，發(fā)揮明顯的抗腫瘤細胞作用，提示黃芩苷是一種高效低毒的抗腫瘤中藥[2]。但是至今為止還未見關于黃芩苷在宮頸癌侵襲轉移過程中作用的報道。本研究發(fā)現，黃芩苷能夠有效抑制宮頸癌細胞的增殖，同時在低于細胞毒性濃度時也能夠有效抑制宮頸癌細胞的侵襲轉移。

腫瘤細胞的侵襲轉移過程極為復雜，許多分子參與其中。在這個過程中腫瘤細胞需要從原發(fā)部位脫離，經過很多環(huán)節(jié)最終到達轉移位點。腫瘤細胞完成這一過程，需要獲得新的特性，這些新的特性的獲得能夠幫助它們從原發(fā)腫瘤脫離、遷移進入周圍組織，滲入循環(huán)系統(tǒng)，到達遠處并最終在到達部位形成新的腫瘤病灶?；|金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)被認為是促使腫瘤細胞完成侵襲轉移過程的關鍵性分子，其中最具有代表性的是MMP-2和MMP-9。研究發(fā)現MMP-2和MMP-9與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關[1,8]。在MMP-2和MMP-9的表達升高后，宮頸癌細胞的侵襲能力明顯增強[9]。而在MMP-2和MMP-9的表達受到抑制之后，宮頸癌的侵襲受到明顯抑制[10]。本研究發(fā)現黃芩苷能夠有效降低MMP-2和MMP-9的轉錄與表達，提示其對宮頸癌細胞侵襲轉移的抑制作用，可能與其對MMP-2和MMP-9表達的抑制作用相關。

P38信號通路對宮頸癌細胞增殖、凋亡等發(fā)揮重要的調節(jié)作用。既往研究發(fā)現，激活P38信號通路能夠有效增強下游多種靶點的表達與活化，其中就包括MMP-2和MMP-9[11-12]。此外研究發(fā)現，P38信號通路能夠通過調節(jié)MMP-9啟動子位點的活性調節(jié)MMP-9的表達，從而進一步調節(jié)細胞的侵襲轉移[13]。在本研究中發(fā)現，黃芩苷能夠降低HeLa細胞P38的磷酸化水平，在與P38信號通路抑制劑聯合應用后，其對HeLa中MMP-2、MMP-9表達的抑制作用明顯增強，提示其對HeLa細胞侵襲轉移的抑制作用可能是通過對P38信號通路的活性的調節(jié)實現的。

綜上所述，本研究發(fā)現黃芩苷能夠有效抑制宮頸癌細胞的侵襲轉移，這種抑制作用與通過下調P38信號通路的活性進一步抑制MMP-2、MMP-9的表達相關。本研究為黃芩苷在宮頸癌臨床治療中的應用奠定了一定的實驗基礎。

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(編輯卓選鵬)

收稿日期：2015-06-25修回日期：2015-10-20

通訊作者：高慶. E-mail: dqinggao@163.com

中圖分類號：R737.33

文獻標志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604027

Inhibitory effect of baicalin on invasion of cervical cancer HeLa cells and its mechanism

ZHANG Yue1, FU Qiao-shan1, LIU Wei2, GAO Qing2

(1. Department of Obstetrics and Gynecology, Xi’an No. 4 Hospital, Xi’an 710004;2. Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the anti-metastatic effect and mechanism of baicalin on the growth of HeLa cells was measured by MTT assay, and cell migration baicalin on human cervical cancer HeLa cells. MethodsThe effects of baicalin on the proliferation and invasion of HeLa cells were analyzed by MTT method and Transwell assay. Moreover, Real-time PCR was used for investigating the expressions of MMP-2 and MMP-9 at the RNA level. Western blot was used for investigating the expressions of MMP-2, MMP-9, P38 and p-P38 at the protein level. ResultsBaicalin could significantly inhibit the proliferation of HeLa cells in the dose-dependent manner at the concentration above 60 μg/mL. Anti-metastatic signaling induced by baicalin was characterized by down-regulating the RNA and protein expressions of MMP-2 and MMP-9, and down-regulating the phosphorylation level of P38. Pre-treatment of P38 signal pathway inhibitor could enhance the inhibitory effect of baicalin on the expressions of MMP-2 and MMP-9. ConclusionThese results indicate that baicalin-induced anti-metastatic effect involves the inhibition of MMP-2 and MMP-9 in HeLa cells through P38 signal pathway.

KEY WORDS:baicalin; HeLa cell; invasion; P38 signal pathway; matrix metalloproteinases (MMP)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160620.0837.002.html(2016-06-20)